豆豉食源性致病菌的快速檢測體系研究.pdf

1、近年來，在世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件頻發(fā)，是影響公共健康的重要因素，食品安全問題越來越成為社會關(guān)注的熱點。我國流行的食源性疾病中，細菌性食物中毒居首位。因此，食品中病原性細菌檢測是食品衛(wèi)生安全檢測中一個重要的部分。目前食源性致病菌的檢測方法主要以傳統(tǒng)微生物學方法為主，不僅操作繁瑣，檢測周期較長，誤檢率高，效率低，一般需要一周左右才能提交檢測報告，而且敏感度、特異性均較低。面對當今食品中存在多種食源性致病菌潛在污染的現(xiàn)狀，目前的檢測方法顯

2、得十分滯后。因此建立快速、高效、準確的食源性致病菌的檢測方法變得越來越迫切。多重PCR是在同一個反應(yīng)體系中同時加入了多對引物、模板從而實現(xiàn)了在同一體系中對多個目的片段的同時擴增的技術(shù)，克服了常規(guī)方法一次只能擴增一個目的片段的缺點，從而為實現(xiàn)多種食源性致病菌的快速和同時檢測，節(jié)省了成本和時間，多重 PCR檢測方法有著更為廣闊的發(fā)展空間。
　　通過檢測金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，SA）nuc基因、單核增

3、生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）hly A基因、奇異變形桿菌（Proteus mirabilis，PM）ure R基因、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus，BC)hbl A基因、阪崎腸桿菌(Enterobacter sakakii，ES)omp A基因、沙門氏菌（Salmonella，SM） inv A基因的方法，建立一種同時檢測六種致病菌的多重PCR體系，以細菌性豆豉為研究材料，提取樣品宏基因

4、組，設(shè)計并篩選多對特異性引物，擴增的目的基因片段長度分別為182 bp、270 bp、376 bp、500 bp、682 bp、867 bp。采用多重 PCR反應(yīng)的預(yù)混液，通過正交分析方法對六對引物進行濃度檢測以確定最佳的反應(yīng)體系，最終反應(yīng)體系為50ul。通過將六種致病菌模板兩兩隨機混合檢測特異性，結(jié)果表明實驗所涉及的六種致病菌均有清晰、特異的目標條帶，而且本研究所建立的檢測六種病原菌的多重體系的靈敏度較高，SA的靈敏度為4.3×103

5、CFU/mL，LM靈敏度為2.4×102 CFU/mL， PM靈敏度為6.1×102CFU/mL，BC的靈敏度為6.4×102 CFU/mL，ES靈敏度為：3.1×102 CFU/ mL，SM的靈敏度為5.0×102 CFU/mL。對貴州不同地區(qū)的48份豆豉樣品進行多重PCR檢測。結(jié)果表明，采用多重方法簡單快速且靈敏度高，整個檢測時間在5h以內(nèi)，這些特點相對于傳統(tǒng)的檢測方法無論是在特異性，靈敏度方面均有很大提高。
　　實際樣品檢測

6、發(fā)現(xiàn)，貴州各地區(qū)豆豉中的食源性致病菌主要有PM、BC和ES，但不同地區(qū)或相同地區(qū)的不同樣品中所含的致病菌種類也不相同。豆豉前發(fā)酵過程中致病菌的動態(tài)檢測中發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵豆豉與純種強化發(fā)酵豆豉中LM和ES在整個發(fā)酵過程中含量基本不變，推測可能是大豆原料中含有的已滅活的菌體。而PM和BC在發(fā)酵過程中的變化趨勢較大。
　　應(yīng)用熒光定量法對奇異變形桿菌和阪崎腸桿菌的研究顯示，奇異變形桿菌的檢測靈敏度為85.8 fg/uL，標準曲線E為105.