單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用-孟衛(wèi)青

1、單克隆抗體技術(shù)及其應(yīng)用,講解人：孟衛(wèi)青,,,,,,,,單克隆抗體技術(shù)簡介,一,二,三,四,五,單克隆抗體的制備過程,基因工程抗體制備技術(shù),鼠源抗體人源化,,,六,七,抗人CD3抗體基本來源,基因工程抗體的廣泛應(yīng)用,已批準(zhǔn)上市的治療性單抗,培訓(xùn)大綱,1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，兩人由此杰出貢獻(xiàn)而榮獲1984年度諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。單克隆抗體（monoclonal antibody）：針對(duì)預(yù)定抗原

2、的同一抗原決定簇的，高度同質(zhì)的，且能保證無限量供應(yīng)的抗體。單克隆抗體技術(shù)的理論依據(jù)：抗體的多樣性、克隆選擇學(xué)說、抗體基因的重排理論、抗體結(jié)構(gòu)與生物合成機(jī)制。,一.單克隆抗體技術(shù)簡介,骨髓瘤細(xì)胞 （SP2/O-Ag14 ）：,1.1 單克隆技術(shù)的原理,喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT－）無法在HAT選擇培養(yǎng)劑中生長能

3、無限地快速增殖 既不合成輕鏈又不合成重鏈,小鼠脾細(xì)胞 （B-Cell ）：,合成和分泌特異性抗體無法進(jìn)行體外長期培養(yǎng),脾細(xì)胞－SP2/O融合細(xì)胞：,HGPRT＋，能在HAT選擇培養(yǎng)劑中生長能無限地快速增殖 合成和分泌特異性抗體,HAT,次黃嘌呤，甲氨喋呤，胸腺嘧啶核苷,,二.單克隆抗體的制備過程,2.1 單克隆抗體制備過程的注意事項(xiàng),嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作，防止污染（細(xì)菌、霉菌、支原體、細(xì)胞）根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞的檢測(cè)與篩選，

4、（ELISA、(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn))IFA（時(shí)間分辨免疫熒光）、凝集、中和…）對(duì)篩選得到的陽性細(xì)胞克隆進(jìn)行早期單克?。ㄓ邢尴♂尫ǎ┰趩慰寺〖?xì)胞建株過程中不定期驗(yàn)證檢測(cè)防止單克隆細(xì)胞過度生長 ——老化 死亡,,細(xì)胞融合的方法：1、仙臺(tái)病毒，2、PEG/DMSO，3、電融合,,2、治療試劑病毒等微生物的中和抗體抗毒素—蛇毒、破傷風(fēng)毒素，等被動(dòng)免疫治療制劑“生物導(dǎo)彈”，腫瘤治療等,3、分子生物學(xué)研究工具蛋白

5、質(zhì)等生物活性分子的純化；細(xì)胞生物學(xué)——組織定位；分子病毒學(xué)——結(jié)構(gòu)分析；特定生物分子的功能研究；,診斷技術(shù)方法：ELISA（間接法、夾心法、競爭法）免疫熒光法膠體金放射免疫法??? ???,2.2.單克隆抗體技術(shù)的應(yīng)用,,,B,,D,,A,,C,污染：培養(yǎng)環(huán)境、操作,抗體分泌不足：支原體污染、細(xì)胞突變、 培養(yǎng)體系有問題,融合細(xì)胞不生長：PEG、血清、HAT培養(yǎng)基,雜交瘤細(xì)胞難以克隆化：血清質(zhì)量、細(xì)胞活性,2.3 單抗制

6、備常見問題,三.基因工程抗體制備技術(shù),鼠源抗體人源化,01,,,02,小分子抗體,,03,抗體融合蛋白,3.1.單抗人源組分的分類,原核表達(dá),抗體人源化,小分子抗體,雙功能抗體,易于改造,親和力成熟,產(chǎn)業(yè)化,3.2 基因工程抗體優(yōu)點(diǎn),抗體名稱 抗體種類 靶向抗原 適應(yīng)癥 批準(zhǔn)日期OKT3 鼠單抗 CD3 移植排斥

7、 1986Panorex 鼠單抗 17-1A 大腸癌 1995ReoPro 人-鼠嵌合Fab 血小板受體 冠心病 1994Rituxan 人-鼠嵌合抗體 CD20 淋巴瘤 1997Simulect 人-鼠嵌

8、合抗體 CD25 移植排斥 1998Remicade 人-鼠嵌合抗體 TNF-α 炎癥性腸病、 1998類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 1999Zanapax 人源化抗體 CD25 移植排斥 1997Herceptin 人源化抗體 HER-2 乳腺癌

9、 1998Synagis 人源化抗體 RSV F蛋白 RSV感染 1998Mylotarg 人源化抗體 - CD33 淋巴瘤 2000 Campath 人源化抗體 CD52 淋巴瘤 2001,,四.已批準(zhǔn)上市的治療性單

10、抗,就是利用DNA重組技術(shù)把鼠單抗的輕鏈、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體的恒定區(qū)域的表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)入合適的宿主表達(dá)出來的抗體。這樣抗體即具有識(shí)別抗原的特異性，又減少了抗體的人抗鼠反應(yīng)。,嵌合抗體,一.,改型抗體,二.,指利用基因工程技術(shù)，將人抗體可變區(qū)（V） 中互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR）AA序列改換成鼠源單抗CDR序列，重構(gòu)成既具有鼠源性單抗的特異性又保持抗體親和力的人源化抗體。,五.鼠源抗體人源化,可變區(qū)基因的克隆表達(dá)載體的構(gòu)建

11、嵌合抗體的表達(dá),5.1嵌合抗體,5.2嵌合抗體抗體制備簡易圖,,六.抗人CD3抗體基本來源,關(guān)系圖譜,1.CD3分子是T細(xì)胞的重要標(biāo)志，由γ、δ、ε、ζ和η五種多肽鏈組成，它們的胞漿區(qū)均含有ITAM，具有傳導(dǎo)TCR信號(hào)的功能，使T細(xì)胞活化。,2.從外周血、骨髓或臍血中分離出的單個(gè)核細(xì)胞在CD3單克隆抗體和多種細(xì)胞因子存在的條件下，經(jīng)過一定時(shí)間培養(yǎng)可以獲得具有腫瘤細(xì)胞殺傷活性的CIK（Cytokine-induced Killer）細(xì)

12、胞,6.1 抗人CD3抗體與免疫細(xì)胞,1 .在腫瘤治療方面的應(yīng)用: 單抗藥物抗腫瘤能有效地降低傳統(tǒng)腫瘤藥物治療的不良反應(yīng)。如2005年我國開發(fā)出癌癥治療藥——重組人源化抗人表皮生長因子受體單克隆抗體(商品名：泰欣生)。泰欣生聯(lián)合放療治療鼻咽癌的完全緩解率比單純放療的患者提高30%以上。2 .在器官移植中的應(yīng)用: 近年來 ,利用抗體藥物作為實(shí)體器官移植的誘導(dǎo)治療逐漸增加。如1986年批準(zhǔn)

13、進(jìn)入美國市場(chǎng)的治療性抗體類藥物抗 CD3單抗即被用于腎、 心臟、 肝臟移植排斥的逆轉(zhuǎn)。 3 .在心血管疾病方面的應(yīng)用： 美國 FDA 于 1994 年批準(zhǔn)了第一個(gè)人-鼠嵌合 Fab 抗體的上市，該抗體現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于多種心血管疾病治療 ,主要用于預(yù)防冠狀動(dòng)脈成形術(shù)后的再狹窄4 .在自身免疫性疾病方面的應(yīng)用: 現(xiàn)有的研究表明 ,抗體對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 系統(tǒng)性紅斑狼瘡、 牛皮癬、 多發(fā)性

14、硬化、 硬皮病、 潰瘍性結(jié)腸炎等療效較好。。。。。,七.基因工程抗體的廣泛應(yīng)用,所以可行的方法就是在完善人抗體技術(shù)的同時(shí)，推進(jìn)治療性小分子抗體衍生物的研究，根據(jù)臨床的實(shí)際設(shè)計(jì)靈活有效的治療方案，使人源化抗體和小分子抗體互為補(bǔ)充。,7.1單抗未來發(fā)展的方向,01,02,抗體人源化以及完全人源化抗體的制備已經(jīng)成為當(dāng)今治療性抗體的發(fā)展趨勢(shì)，同時(shí)，各種抗體衍生物免疫原性低、更易通過血管壁到達(dá)病源，通過PEG化等方法可以延長其半衰期；,03,人抗

15、體是否可以解決鼠抗體運(yùn)用中出現(xiàn)的所有問題，還有待大量臨床試驗(yàn)的檢驗(yàn)。,01,減少降低了機(jī)體的免疫排斥反應(yīng),02,募集效應(yīng)因子或效應(yīng)細(xì)胞,03,在體內(nèi)的半衰期長,7.2 人源化抗體優(yōu)點(diǎn),對(duì)于該現(xiàn)象的解釋是：人源化抗體中的Fc段可以特異結(jié)合人血管內(nèi)皮細(xì)胞上的Fc受體（FcRn)，使抗體內(nèi)化到血管內(nèi)皮細(xì)胞而不被降解，并能夠回到血液中參與循環(huán)。鼠抗體由于不能有效的與人FcRn結(jié)合而很快從循環(huán)系統(tǒng)中清除。,7.3抗體生產(chǎn)生物反應(yīng)器,,謝謝!聆聽