OUT基因表達(dá)載體的構(gòu)建及棉花黃萎菌轉(zhuǎn)化和基因沉默抑制功能初步研究.pdf

1、棉花黃萎病是世界上棉花作物的難治性病害。棉花黃萎菌病毒VdCV1本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道,但對(duì)該病毒功能及其基因功能尚未做實(shí)驗(yàn)研究。研究建立快速高效的黃萎菌遺傳轉(zhuǎn)化方法,進(jìn)而建立真菌病毒ATMT法的侵染性克隆體系,對(duì)研究棉花、棉花黃萎菌以及棉花黃萎菌病毒三者之間的互作關(guān)系,以及對(duì)真菌病毒及其基因功能研究具有重要意義。本文為此作前期研究和探索。
　　 本研究首先以植物表達(dá)載體PH7WG2D為基本骨架,通過(guò)重疊PCR技術(shù)將病毒VdCV1的O

2、UT基因序列。VcR4進(jìn)行改造,獲得含35S+VcR4+Ribozyme+Nos序列的attBPCR產(chǎn)物,通過(guò)Gateway技術(shù)的BP反應(yīng)構(gòu)建入門載體,入門載體與雙元表達(dá)載體pH7WG2D通過(guò)LR反應(yīng)構(gòu)建雙元表達(dá)載體PHVcR4,經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序分析表明載體構(gòu)建成功。然后,以植物表達(dá)載體PK7WG2D為基本骨架,通過(guò)同樣的方法改造潮霉素基因,使其含有trpC啟動(dòng)子和Nos終止子,成功構(gòu)建了雙元表達(dá)載體PKHyg。
　　

3、 利用低濃度放線菌酮處理結(jié)合菌絲尖端分離脫毒和光照培養(yǎng)的方法處理棉花黃萎菌0-21,經(jīng)過(guò)RT-PCR驗(yàn)證得到脫病毒菌株0-21。以構(gòu)建的載體PHVcR4、PKHyg轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101,以及所購(gòu)用于真菌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(ATMT)的載體pBHt1農(nóng)桿菌C58C1,采用ATMT法轉(zhuǎn)化棉花黃萎菌。結(jié)果顯示,PHVcR4質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黃萎菌獲得了具有綠色熒光的孢子和菌絲,但未能獲得具有抗性的轉(zhuǎn)化子,原因可能是表達(dá)質(zhì)粒中的目的片段未能整合

4、到棉花黃萎菌基因組中,綠色熒光屬于GFP瞬時(shí)表達(dá),或者可能是表達(dá)質(zhì)粒中的目的片段整合進(jìn)了棉花黃萎菌基因組,但啟動(dòng)子未啟動(dòng)潮霉素基因轉(zhuǎn)錄。PKHyg質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黃萎菌時(shí)在熒光倒置顯微鏡下未見到綠色熒光,抗生素篩選也未能獲得轉(zhuǎn)化子,可能與載體PK7WG2D不適合作為真菌轉(zhuǎn)化載體有關(guān)。pBHt1質(zhì)粒農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黃萎菌未能篩選到具有抗性的轉(zhuǎn)化子,可能與農(nóng)桿菌菌株為C58C1有關(guān)。黃萎菌的轉(zhuǎn)化有待進(jìn)一步分析驗(yàn)證和改進(jìn)。
　　 采用瞬時(shí)表達(dá)