水牛抑制素α基因RNAi載體構(gòu)建與沉默效率檢測(cè).pdf

1、抑制素(Inhibin,Inn)通過(guò)反饋?zhàn)饔靡种拼俾雅菟氐暮铣膳c分泌,影響動(dòng)物的卵泡發(fā)育和排卵。為探討應(yīng)用RNAi技術(shù)沉默INH-α基因提高水牛繁殖力的可行性,本研究構(gòu)建了水牛抑制素α亞基的RNAi載體,并在細(xì)胞水平對(duì)其沉默效率進(jìn)行了檢測(cè)。
　　 1.以pSliencer4.1-CMV neo載體為骨架,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了pSliencer4.1-145、pSliencer4.1-308、pSliencer4.1-769、pSlien

2、cer4.1-1013和pSliencer4.1-1053共5個(gè)針對(duì)水牛INH-α基因的RNAi載體。載體用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染水牛顆粒細(xì)胞,48h后應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)進(jìn)行沉默效率的檢測(cè)。結(jié)果顯示:針對(duì)308、769、1013和1053位點(diǎn)的抑制效率分別為58.8％、44.9％、67.4％和43.9％,145位點(diǎn)無(wú)抑制效果。選擇抑制效率最高的pSliencer4.1-1013轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞,檢測(cè)24h、48h、72h和96h

3、后的抑制效率表明基因沉默具有時(shí)效性,轉(zhuǎn)染48h后抑制效率最高,此后逐漸減弱。
　　 2.以1013位點(diǎn)為核心序列,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了以pSico-PGK1為骨架的RNAi慢病毒載體pSico-PGK1-CMV-1013。通過(guò)pSico-PGK1-CMV-1013、psPAX2和pCMV-VSV-G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝病毒,經(jīng)批量快速測(cè)定法(LaSRT)測(cè)定病毒滴度達(dá)到4x107 IU/mL,用病毒感染水牛顆粒細(xì)胞72h后,qRT

4、-PCR檢測(cè)INH-α的抑制效率為26.8％。
　　 3.探討了應(yīng)用microRNA原理進(jìn)行卵巢組織特異性沉默水牛INH的可行性。設(shè)計(jì)并構(gòu)建了2個(gè)以pEGFP-C1為骨架基于內(nèi)含子microRNA原理的干擾載體pEGFP-C1-18a-1013和pEGFP-C1-155-1013。轉(zhuǎn)染顆粒細(xì)胞48h后的檢測(cè)結(jié)果顯示pEGFP-C1-155-1013具有49.4％的抑制效率,而pEGFP-C1-18a-1013未表現(xiàn)抑制作用。