應(yīng)激過程中組織和細(xì)胞內(nèi)HSPs表達(dá)與應(yīng)激性損傷機理研究.pdf

1、隨著中國養(yǎng)豬業(yè)集約化程度的不斷提高，規(guī)?；B(yǎng)豬場豬的轉(zhuǎn)場等所面臨的中、長途運輸問題越來越普遍，造成的損失也越來越明顯．了解和研究運輸應(yīng)激損傷特征和規(guī)律以及采取合理的措施減少運輸應(yīng)激造成的危害具有重要意義．熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一組高度保守的蛋白，對維持細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著十分重要的作用．本丈主要通過建立運輸應(yīng)激模型來動態(tài)觀察運輸應(yīng)激過程中豬組織中的HSPs的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，研究HSPs的變化規(guī)

2、律與豬應(yīng)激性損傷之間的相關(guān)性；通過原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞建立體外熱應(yīng)激模型，探討HSPs的組織細(xì)胞保護機制．
　　 體內(nèi)試驗：選取皮特蘭和二花臉雜交二代仔豬20頭在相同的環(huán)境條件下飼養(yǎng)，待體重達(dá)到50±2kg時，隨機分成4組，一組作為對照組飼養(yǎng)在正常飼養(yǎng)環(huán)境中，其余三組在常規(guī)路段分別進行1h、2h和4h的運輸（車速為30-40千米/小時）．運輸結(jié)束后，將所有運輸組和對照組豬均先注射戊巴比妥鈉(10mg/kg)后再進行剖殺．分離血清

3、，檢測血清生化指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶( ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶( LDH)、肌酐(Cr)和尿素氮（BUN）．采取心臟、肝臟、胃和背最長肌，一部分于4％多聚甲醛溶液中固定，用于組織病理學(xué)檢測，另一部分則速凍并于液氮中保存，用于ELISA和熒光定量RT-PCR研究．部分背最長肌用于肉質(zhì)檢測．
　　 體外試驗：原代培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞72h后，將細(xì)胞分成9組(對照組和熱應(yīng)激10min、20min、40m

4、in、60min、120min、240min、360min、480 rain)．按照分組給予相應(yīng)的熱應(yīng)激后，取各組培養(yǎng)液用于生化指標(biāo)ALT、LDH、CK、CK的同工酶(CKMB)和a-羥基丁酸脫氫酶(Hydroxybutyrate dehydrogenase，HBDH)的檢測；取各組心肌細(xì)胞分別進行免疫組織化學(xué)、Western blot、熒光定量RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)等檢測．
　　 運輸后血清生化指標(biāo)ALT、AST、CK，LD

5、H和Cr均極顯著升高(P<0.01)，肝臟和心臟實質(zhì)細(xì)胞主要表現(xiàn)為以急性退行性變化為主要特征的急性損傷．Hsp27的表達(dá)水平在運輸2h后的心臟內(nèi)和運輸4h的肝臟內(nèi)顯著升高（P<0.01），同時伴有hsp27mRNA在運輸1h后的心臟和肝臟內(nèi)的顯著升高（P<0.01）．αB-crystallin在整個運輸過程中的心臟和肝臟中的表達(dá)規(guī)律起伏不定（P>0.05），但是，αB-crystallin mRNA水平在運輸1h后的心臟中顯著升高，而在

6、運輸1h和2h的肝臟中卻顯著降低。結(jié)論：心臟和肝臟細(xì)胞的損傷在運輸1h后最明顯，Hsp27和αB-crystallin的表達(dá)在豬的運輸過程中顯示出了組織特異性．
　　 運輸應(yīng)激后豬胃臟黏膜皺褶上的主細(xì)胞有不同程度的脫落．表明經(jīng)過4h的運輸后，豬胃黏膜的完整性遭到破壞。運輸2h后，胃組織中的Hsp90表達(dá)量顯著下降(P<0．01)，但經(jīng)過1h、2h和4h運輸后，各組豬胃臟中Hsp70水平均顯著高于對照組(P<0.05)．Hsp27

7、的表達(dá)水平在整個運輸過程中相對穩(wěn)定，胃中aB-crystallin的表達(dá)在運輸4h后顯著高于對照組（P<0.05）．HSPs的不同表達(dá)變化提示不同的Hsp在運輸應(yīng)激豬胃中發(fā)揮不同的功能．調(diào)節(jié)HSPs表達(dá)的HSF-1的水平在運輸過程中基本保持穩(wěn)定。提示在運輸應(yīng)激過程中，HSF-1不是調(diào)節(jié)HSPs表達(dá)的唯一因素．
　　 運輸1h和2h后，豬背最長肌肉的初始和最終pH（pHi和pHu）均降低，汁液損失和L+值與對照組相比均升高，顯示出

8、PSE肉的特征．運輸2h后的肉質(zhì)低于運輸lh和4h．運輸應(yīng)激后，四種被檢熱休克蛋白（a[B-c、Hsp27、Hsp70和Hsp90）在豬背最長肌中的表達(dá)均呈降低趨勢．導(dǎo)致運輸應(yīng)激后豬背最長肌肉品質(zhì)下降的可能原因之一是HSPs的表達(dá)降低。
　　 體外實驗結(jié)果顯示：培養(yǎng)液中ALT、LDH、CK、CKMB在熱應(yīng)激后均有不同程度的升高．免疫組化結(jié)果顯示，在熱應(yīng)激過程中，Hsp27在心肌細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中分布不同，HSF-1則相對穩(wěn)定

9、的分布于細(xì)胞核中．Wsstern Blot結(jié)果顯示Hsp27的表達(dá)在熱應(yīng)激8h后顯著升高，HSF-1的表達(dá)在熱應(yīng)激10min、40min、60 min和120 min時顯著降低，而在240 min后極顯著升高。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示hsp27mRNA和hsf-1 mRNA在熱應(yīng)激10min后均顯著或極顯著升高．結(jié)果表明在持續(xù)熱應(yīng)激后，大鼠心肌細(xì)胞受到一定的損傷；Hsp27在熱應(yīng)激過程中發(fā)揮一定的作用；Hsp27和HSF-1的表達(dá)與其

10、相應(yīng)mRNA水平不同步，可能與其在熱應(yīng)激過程中被磷酸化有關(guān)．流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，除熱應(yīng)激40min和480min時，細(xì)胞凋亡率分別極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)高于相應(yīng)的對照組外，熱應(yīng)激處理的其它各試驗組離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的凋亡率與相應(yīng)對照組相比，差異均不顯著。表明急性熱應(yīng)激可以誘導(dǎo)細(xì)胞啟動某種自我保護機制以適應(yīng)外界環(huán)境的改變．蛋白定量檢測結(jié)果顯示，在應(yīng)激20min后，Cleaved caspase-3極顯著升高，并持