大鼠心肌細(xì)胞Hsp60-Hsp10的表達(dá)及抗熱應(yīng)激損傷機理研究.pdf

1、季節(jié)性氣候因素對養(yǎng)殖業(yè)的影響不容忽視，作為一個養(yǎng)殖業(yè)大國，我國每年由熱應(yīng)激造成的養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失十分驚人。因此，增加針對動物的熱應(yīng)激損傷特征和規(guī)律研究對減少熱應(yīng)激損傷具有重要意義。熱應(yīng)激是一種全身性的反應(yīng)，對動物的行為、采食量、生產(chǎn)性能、血液循環(huán)、神經(jīng)內(nèi)分泌、免疫和生殖等方面均會產(chǎn)生不利影響。但熱應(yīng)激過程中可轉(zhuǎn)錄合成一組具有高度保守性的特殊蛋白-熱休克蛋白(heat shockproteins，Hsps)對維持細(xì)胞生存和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定也起著

2、十分重要的作用。熱休克蛋白60(Hsp60)作為熱休克蛋白家族重要的一員，已被證明與心血管疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本文的主要目的在于通過對大鼠和離體培養(yǎng)的鼠源H9C2心肌細(xì)胞進(jìn)行不同時間的熱應(yīng)激處理，擬動態(tài)觀察和了解熱應(yīng)激大鼠心肌細(xì)胞中Hsp60及其相應(yīng)mRNA的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，以及Hsp60在體內(nèi)、外心肌細(xì)胞中的定位和分布等特點，研究熱應(yīng)激過程中Hsp60的變化規(guī)律與大鼠心肌細(xì)胞熱應(yīng)激損傷的相關(guān)性，探討Hsp60的

3、組織細(xì)胞保護機制。
　　為研究熱應(yīng)激對體內(nèi)、外大鼠心肌細(xì)胞造成的應(yīng)激性損傷及其程度，本試驗通過病理學(xué)檢測，觀察了受試大鼠心肌細(xì)胞和鼠源H9C2心肌細(xì)胞在遭受不同時間的熱應(yīng)激處理后所呈現(xiàn)的應(yīng)激性損傷變化。試驗結(jié)果顯示，熱應(yīng)激處理初期，受試大鼠的呼吸頻率加快，被毛粗亂，煩躁不安，隨后大量出汗，俯臥少動。待熱應(yīng)激處理至60 min時出現(xiàn)大鼠的熱應(yīng)激猝死，熱應(yīng)激處理100 min后，50％的受試大鼠猝死，熱應(yīng)激處理2h內(nèi)，100％的受試大

4、鼠發(fā)生猝死;離體培養(yǎng)的H9C2心肌細(xì)胞在遭受熱應(yīng)激的時間達(dá)60 min時，細(xì)胞的活力和存活率開始顯著下降，熱應(yīng)激處理240 min后，約50％的H9C2大鼠心肌細(xì)胞死亡。說明離體培養(yǎng)的H9C2大鼠心肌細(xì)胞對熱應(yīng)激的耐受時間更長;組織病理學(xué)結(jié)果顯示，熱應(yīng)激處理20 min后大鼠心肌細(xì)胞腫脹，心肌細(xì)胞質(zhì)渾濁，呈現(xiàn)明顯的顆粒變性。熱應(yīng)激處理40 min組大鼠的部分心肌細(xì)胞發(fā)生明顯的顆粒變性，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性顯著增強。熱應(yīng)激處理至100 min組大

5、鼠的心肌細(xì)胞斷裂較為明顯，心肌細(xì)胞核濃縮;細(xì)胞病理學(xué)結(jié)果顯示，20 min熱應(yīng)激處理組H9C2大鼠心肌細(xì)胞的體積腫大，形態(tài)變圓，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)少量的紅染顆粒。40 min熱應(yīng)激處理組心肌細(xì)胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)較多的紅染顆粒。60 min熱應(yīng)激處理組H9C2大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)脫落現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)變圓且細(xì)胞邊緣出現(xiàn)不規(guī)則的突起，細(xì)胞體積顯著變大，胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量密集分布的紅染顆粒。熱應(yīng)激導(dǎo)致的大鼠心肌細(xì)胞和離體培養(yǎng)鼠源H9C2大鼠心肌細(xì)胞的病理學(xué)變化均隨

6、著熱應(yīng)激處理時間的延長而加劇，但離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞表現(xiàn)出更強的熱應(yīng)激耐受性。
　　為研究動物心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp60表達(dá)變化在熱應(yīng)激性心肌損傷以及動物猝死中的作用，本試驗通過熱應(yīng)激過程中體內(nèi)、外大鼠心肌細(xì)胞中Hsp60及其相應(yīng)mRNA的表達(dá)水平和在細(xì)胞的定位等進(jìn)行了動態(tài)觀察，并對Hsp60表達(dá)改變與心肌的熱應(yīng)激損傷的相關(guān)性進(jìn)行了比較分析。結(jié)果顯示，體內(nèi)、外大鼠心肌細(xì)胞中Hsp60蛋白及其mRNA表達(dá)量隨著熱應(yīng)激時間的增加而顯著升高，雖然

7、Hsp60蛋白在體內(nèi)、外的表達(dá)水平未出現(xiàn)在同一時間點的一致升高，但其表達(dá)變化出現(xiàn)的時間與各自細(xì)胞組織病理學(xué)損傷程度相一致。Hsp60的表達(dá)變化反映了體內(nèi)、外心肌細(xì)胞損傷程度的變化;不管是在體動物的心肌細(xì)胞還是離體培養(yǎng)的H9C2大鼠心肌細(xì)胞，Hsp60蛋白都只存在于心肌細(xì)胞的細(xì)胞漿，細(xì)胞核中沒有檢測到Hsp60的分布。但隨著熱應(yīng)激時間的延長，Hsp60在細(xì)胞內(nèi)的分布逐漸向細(xì)胞膜方向擴散，說明熱應(yīng)激可能會導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的Hsp60發(fā)生跨

8、膜轉(zhuǎn)移。
　　Hsp60可以與多種因子相互作用，其中，Hsp10是公認(rèn)的Hsp60發(fā)揮分子伴侶作用的輔助因子。為了進(jìn)一步研究哺乳動物心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp60的表達(dá)與動物對環(huán)境應(yīng)激的耐受機制，本試驗對Hsp60相關(guān)蛋白Hsp10在熱應(yīng)激大鼠心肌細(xì)胞中的表達(dá)和定位進(jìn)行了動態(tài)檢測。結(jié)果顯示，與熱應(yīng)激過程中離體培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp60蛋白的表達(dá)變化不同，心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp10表達(dá)水平在熱應(yīng)激過程中無顯著變化。但在體和離體大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)h

9、sp10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平則表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢，表現(xiàn)出與hsp60 mRNA相一致的變化。在熱應(yīng)激初期，離體培養(yǎng)大鼠H9C2心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp60和Hsp10轉(zhuǎn)錄水平的降低程度不如其在體大鼠心臟中的降低水平顯著，這可能與它們對熱應(yīng)激的耐受度不同有關(guān)。不同于Hsp60，Hsp10在熱應(yīng)激后H9C2心肌細(xì)胞中的定位有較為明顯的向細(xì)胞核方向聚集的趨勢，推測Hsp60和Hsp10在熱應(yīng)激過程中既共同發(fā)揮作用，又有各自的功能。
　　熱應(yīng)

10、激處理后，H9C2大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)Hsp60的分布會逐漸向細(xì)胞膜的方向擴散，當(dāng)熱應(yīng)激時間進(jìn)一步增加時，免疫熒光能夠檢測到細(xì)胞膜上有Hsp60的密集分布。因此推斷，Hsp60可能進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境并發(fā)揮其生理功能。為了進(jìn)一步驗證該推斷，本試驗檢測了H9C2大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Hsp60的含量，證實在熱應(yīng)激H9C2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Hsp60的含量增加。通過在體外培養(yǎng)的H9C2大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入過量的山羊抗鼠Hsp60抗體，以中和熱應(yīng)激

11、后心肌細(xì)胞外環(huán)境中的Hsp60蛋白，然后再檢測熱應(yīng)激H9C2心肌細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，在H9C2大鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入Hsp60抗體后再對心肌細(xì)胞進(jìn)行熱應(yīng)激處理，心肌細(xì)胞的凋亡率顯著升高，說明細(xì)胞外Hsp60對熱應(yīng)激大鼠心肌細(xì)胞有保護作用。對其機理進(jìn)行進(jìn)一步研究表明，其機制與ERK、JNK的激活有關(guān)，與P38磷酸化關(guān)系不顯著。而且ERK主要參與了Hsp10對細(xì)胞作用的調(diào)節(jié)。抑制細(xì)胞外的Hsp60后，熱應(yīng)激后H9C2大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)