長途運輸應(yīng)激豬組織損傷與hsps mRNA轉(zhuǎn)錄、HSPs表達相關(guān)性研究.pdf

1、應(yīng)激是機體受到應(yīng)激性刺激后所產(chǎn)生的一種非特異性反應(yīng)，適當?shù)膽?yīng)激對機體有利，但是過強或維持時間過長的應(yīng)激可以造成組織和器官的病理性損傷，甚至導(dǎo)致動物猝死。運輸應(yīng)激每年為世界經(jīng)濟帶來巨大損失，且目前國際上對運輸應(yīng)激沒有統(tǒng)一的判定標準。應(yīng)激時，組織細胞中的熱休克蛋白(HSPs)的含量會發(fā)生急劇變化，維持細胞內(nèi)環(huán)境平衡，幫助細胞耐過生物逆境。本試驗將在相同環(huán)境中飼養(yǎng)的18頭出欄育肥豬隨機均分為A～F等6組，每組3 頭。試驗當日，對照組豬(A組

2、)處于正常飼養(yǎng)環(huán)境，其他各試驗組豬用動物運輸車 輛務(wù)別進行1h(B組)、2h(C組)、4h(D組)、6h(E組)和10h(F組)的運輸應(yīng)激，路途運輸模擬國內(nèi)普通等級公路的運輸狀況(當時室外溫度為18-25℃)，速度控制在50-60km．h<'-1>，整個運輸過程沒有飲水和喂食。對運輸應(yīng)激到試驗設(shè)定時間的試驗組豬進行及時剖殺，采取血液，分離血清用于肌酸激酶(CK)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的檢測；采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)等組

3、織一份，固定于10％中性福爾馬林溶液中，用于病理組織學觀察和Hsp27、Hsp70以及Hsp90的免疫組織化學檢測；同樣兩份組織樣品用液氮速凍后，凍存于-70℃冰箱，用于hsp70mRNA和hsp90mRNA定位和定量檢測，探討長途運輸應(yīng)激豬組織損傷與hsps mRNA轉(zhuǎn)錄、HSPs表達之間的相關(guān)性。 利用組織學以及臨床病理學等方法，研究長途運輸應(yīng)激對育肥出欄豬組織的應(yīng)激性損傷。結(jié)果表明：長途運輸應(yīng)激初期(1～2h)，反映組織損傷的肌

4、酸激酶(CK) 和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)在血液中的含量都顯著升高(P＜O.05)；運輸應(yīng)激4h時，CK 及AST活性有所下降，和對照組相比差異不顯著(P＞0.05)；而當運輸應(yīng)激持續(xù)到6h 和10h時，CK和AST活性又顯著升高。組織學觀察，在長途運輸應(yīng)激初期(1～2 h)， 所檢組織均出現(xiàn)毛細血管擴張充血、細胞急性腫脹等急性病理性損傷變化,損傷程度 較為嚴重；運輸應(yīng)激4h時，各組織的病理損傷與應(yīng)激初期相似，但血管的充血程度

5、有所減輕；運輸應(yīng)激持續(xù)到6～10 h時，各組織尤其心肌纖維的損傷程度進一步加劇。 長途運輸應(yīng)激可以導(dǎo)致組織細胞應(yīng)激性損傷，并且組織的損傷程度隨著應(yīng)激時間的延長有所波動。 利用免疫組織化學方法，研究HsPs在長途運輸應(yīng)激育肥豬組織細胞中的分布。結(jié)果顯示，Hsp70、Hsp90以及Hsp27在組織細胞中的定位無肉眼可見的隨著應(yīng)激時間的延長而發(fā)生的相應(yīng)變化，但是不同的HSPs在組織細胞中的分布有較大差異。Hsp70在肺臟細支氣管粘膜

6、層、心肌纖維胞漿、肝細胞的胞漿和胞核、淋巴結(jié)和脾臟的血管壁、背最長肌纖維的胞漿和部分胞核以及腎小管上皮細胞的胞漿和部分胞核中均有強陽性著色；Hsp90在肺臟細支氣管粘膜層、心肌纖維和肝細胞的胞漿、淋巴結(jié)和脾臟中的血管壁以及部分淋巴細胞、背最長肌纖維的胞漿和部分胞核以及部分腎小管上皮細胞的胞漿中高表達；Hsp27在肺臟細支氣管的粘膜下層、心肌纖維和肝細胞胞漿、背最長肌纖維的胞漿和胞核以及受檢組織的血管壁及內(nèi)皮細胞中呈強陽性表達。

7、根據(jù)hsp70和hsp90 mRNA的基因序列，設(shè)計并合成引物，將PCR擴增的基因片段克隆到pGEM-T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定，利用體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，制作RNA探針，建立檢測lasps mRNA的原位雜交方法。利用自建的原位雜交方法，對lasp70 mRNA、hs090 mRNA進行組織細胞定位，探討hsps mRNA組織細胞定位與HSPs組織細胞定位以及運輸應(yīng)激造成的組織損傷之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：hsp70 mRNA和hsp90mR

8、NA廣泛分布于各組織細胞中，尤其在細胞核中相對集中，在腎小管上皮細胞胞漿中也呈強陽性著色。 根據(jù)hsp70、hsp90和GAPDH mRNA的基因序列，設(shè)計并合成引物，將PCR擴增的基因片段克隆到pGEM-T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定，體外轉(zhuǎn)錄出RNA，梯度稀釋作為陽性標準品，用于標準曲線的制定和樣品檢測，建立了一步法實時熒光定量RT-PCR技術(shù)平臺，并對其有效率、敏感性、特異性進行了檢測。結(jié)果證明，我們建立的一步法實時熒光定量

9、RT-PCR技術(shù)平臺可以真實的反映反應(yīng)管中模板的數(shù)量，可以用于mRNA水平的檢測。利用自建的豬hsps mRNA熒光定量RT-PCR技術(shù)平臺，對長途運輸豬各組織中hsp70和hsp90 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，探討長途運輸應(yīng)激豬組織損傷與各組織中hsps mRNA轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性，為hsps mRNA作為機體應(yīng)激的生物標識提供試驗數(shù)據(jù)。經(jīng)1、2、4、6和10 h的運輸應(yīng)激后，所檢組織中hsp70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨著運輸應(yīng)激時間的延長

10、呈現(xiàn)出上升的趨勢，運輸應(yīng)激到10 h時，hsp70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在肝臟、心臟、肺臟、淋巴結(jié)、腎臟和背最長肌組織中分別為對照組的2.5、4.1、23、9.6、14.2和5.1倍；hsp90 mRNA在不同組織中隨著運輸應(yīng)激時間的延長其變化趨勢波動較大。運輸應(yīng)激可以影響hsps mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，并且對不同家族的hsps mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響不同。hsp70 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨著運輸應(yīng)激時間的延長一直上升，可作為豬運輸應(yīng)激的

11、生物標識之一。 準確稱量組織樣品，進行組織研磨、勻漿、低溫離心，SDS-PAGE電泳，利用單 克隆抗體建立間接法HSPs Western blotting檢測方法；并通過組織勻漿液點硝酸纖維素膜，建立間接法HSPs Dot blotting檢測方法，并對兩種方法進行了比較。Westernblotting檢測方法可以通過SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)按分子量分開，通過單抗識別、灰度分析，對特種蛋白質(zhì)進行準確定量，但是需要進行