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1、應(yīng)激是機(jī)體受到應(yīng)激性刺激后所產(chǎn)生的一種非特異性反應(yīng),畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展以及國(guó)內(nèi)外畜禽貿(mào)易的繁榮,畜禽運(yùn)輸成為畜牧業(yè)中的必要環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)隨機(jī)選擇相同環(huán)境中飼養(yǎng)的6頭夏南牛(♂),用牛用動(dòng)物運(yùn)輸車進(jìn)行運(yùn)輸應(yīng)激,運(yùn)輸時(shí)間為運(yùn)輸前1h、運(yùn)輸前0h;運(yùn)輸2h、3h、9h、10h、15h、20h;運(yùn)輸后10h、20h、30h。道路包括城市道路、國(guó)道、高速的混合路,速度控制在60-70km/h,整個(gè)運(yùn)輸過(guò)程沒(méi)有飲水和喂食。對(duì)試驗(yàn)肉牛進(jìn)行及時(shí)采取血液,分
2、離血清、血漿、淋巴細(xì)胞,分離的血清和血漿予-20℃保存,分別用于皮質(zhì)醇(Cor)和促腎上激素(ACTH)的檢測(cè),分離淋巴細(xì)胞于-80℃保存,通過(guò)RT-PCR克隆了肉牛外周血淋巴細(xì)胞中受運(yùn)輸脅迫誘導(dǎo)基因,用于熱應(yīng)激蛋白(HsP8)酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢涮和對(duì)應(yīng)mRNA在不同運(yùn)輸時(shí)間階段的表達(dá)特性。從而探討肉牛在長(zhǎng)途運(yùn)輸過(guò)程中熱應(yīng)激蛋白(HSPs)表達(dá)及其對(duì)應(yīng)的mRNA轉(zhuǎn)錄規(guī)律,及其它們之間的相關(guān)性。
利用RT-PCR方法克隆了1個(gè)肉
3、牛運(yùn)輸脅迫誘導(dǎo)基因;HSP70,其基因克隆片段長(zhǎng)度為985bp。BLASTX搜索結(jié)果顯示,克隆基因編碼的核苷酸序列與多個(gè)動(dòng)物中的熱激蛋白HSP70同源性很高,其中與牛的AY662497.1、綿羊的EF197836.1和野豬的NM_213766.1序列同源性分別高達(dá)99%、99%和97%。
利用放射免疫法對(duì)激素水平進(jìn)行分析,研究長(zhǎng)途運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)肉牛激素水平的影響。結(jié)果表明,試驗(yàn)牛血清皮質(zhì)醇(Cor)在運(yùn)輸前較低,在運(yùn)輸10h、
4、15h和20h極顯著增加(P<0.01),運(yùn)輸?shù)竭_(dá)后慢慢恢復(fù)到正常水平。在運(yùn)輸前試驗(yàn)牛血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)較低,運(yùn)輸3h時(shí)極顯著升高(P<0.01),這種升高趨勢(shì)持續(xù)到運(yùn)后20h,運(yùn)達(dá)后30小時(shí)恢復(fù)正常水平。
實(shí)時(shí)熒光定量法探討了運(yùn)輸應(yīng)激牛淋巴細(xì)胞中HSPsmRNA轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果證明,試驗(yàn)牛的外周血淋巴細(xì)胞的HSP70mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在運(yùn)輸3h、9h顯著增加(P<0.05),隨后表達(dá)恢復(fù)到運(yùn)輸前水平;HSP
5、27mRNA轉(zhuǎn)錄水平在運(yùn)輸3h顯著升高(P<0.05);HSP90mRNA轉(zhuǎn)錄水平僅在運(yùn)后10h開(kāi)始升高,并在運(yùn)后20h極顯著升高(P<0.01),達(dá)到最大值。商業(yè)化試劑盒ELISA測(cè)定運(yùn)輸應(yīng)激肉牛外周血淋巴細(xì)胞中的HSP70、HSP27和HSP90的水平。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線法完成樣品定量,用β-actin控制蛋白提取過(guò)程中出現(xiàn)的誤差。結(jié)果顯示,試驗(yàn)牛的外周血淋巴細(xì)胞的HSP70在運(yùn)輸2h、3h、9h的表達(dá)極顯著增加(P<0.01),隨后表達(dá)
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