胸腺素alpha-1基因的克隆、表達(dá)及其對淋巴細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:人工合成胸腺素α1(thymosin alpha1,Tα1)三串體(Tα1③)的串聯(lián)基因及Tα1和Ref(一種P1噬菌體蛋白)的重組基因,克隆至原核表達(dá)載體,構(gòu)建高表達(dá)菌株,利用基因工程方法實現(xiàn)Tα1三串體及Ref-Tα1重組蛋白的高效表達(dá),并進(jìn)行目的蛋白的純化及生物學(xué)活性的鑒定.方法:使用大腸桿菌偏愛密碼子,人工合成Tα1③和Ref-Tα1基因,并分別克隆在表達(dá)載體pET-22b(+)和pBV220中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE

2、3)和DH5α,通過加入IPTG及控制溫度誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)的目的蛋白分別經(jīng)DEAE-Sepharose FF陰離子柱及CM-Sepharose FF陽離子柱進(jìn)行純化,Western-blot進(jìn)行鑒定,體外淋巴細(xì)胞增殖試驗進(jìn)行生物學(xué)活性測定.結(jié)果:PCR分別擴(kuò)增出280bp和360bp的DNA片段,將其克隆入pET-22b(+)和pBV220中,酶切和測序鑒定正確.用IPTG及溫控分別誘導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)和DH5α,

3、各得到大小約10KD和15KD的串聯(lián)及重組蛋白,合成的蛋白以可溶性形式存在,培養(yǎng)的細(xì)菌經(jīng)收集、裂解后,合成的目的蛋白釋放出來,并采用離子層析純化,獲得了純化的目的蛋白.體外淋巴細(xì)胞增殖試驗表明,兩種表達(dá)蛋白都具有明顯的生物學(xué)活性.結(jié)論:該研究成功地克隆、表達(dá)和純化了Tα1③和Ref-Tα1蛋白,表明用基因串聯(lián)和重組的方法表達(dá)小分子多肽是一種可行的方法,為今后的大批量生產(chǎn)和應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ),也為表達(dá)其它的小分子蛋白質(zhì)提供了很好的方向.