人胸腺素α原基因的克隆表達及其生物活性的初步研究.pdf

1、Goldstein等于1966年自小牛胸腺中首次提取到具有免疫調節(jié)活性的物質，并命名為胸腺素。其后經過30余年的臨床研究，一些胸腺激素或胸腺肽制劑已作為一種免疫調節(jié)劑類藥物廣泛應用于臨床，在治療或減輕原發(fā)性免疫缺陷、病毒或細菌感染、自身免疫和癌癥等疾病方面取得了較好的療效。目前臨床上所用的胸腺素主要是由小牛胸腺中純化得到的胸腺素F5組分(TF5)，其中含有40余種肽類，相對分子質量為1000-15000Da。胸腺素α原(ProTα)的N

2、端含有完整的胸腺素α1(Tα1)28肽。ProTα具有與Tα1相似甚或更高的免疫調節(jié)活性。由于在免疫和細胞生長調控方面的廣泛作用，ProTα在其被發(fā)現(xiàn)后的20多年里，一直作為胸腺素家族中的研究重點而備受人們的關注。 本實驗從中國人外周血中提取總RNA，反轉錄為cDNA，以其為模板，設計引物，利用PCR技術擴增出ProTα基因，將成熟ProTα的編碼框序列構建到原核表達載體pGEX 6P-1中，在氨芐青霉素平板上篩選抗性轉化子，并

3、經PCR，雙酶切鑒定，挑選出陽性克隆子，DNA測序正確，表明成功地構建了原核表達載體pGEX-α。將重組載體pGEX-α化宿主菌BL21(DE3)，異丙基-β-D-半乳糖(IPTG)誘導表達目的蛋白。SDS-PAGE分析鑒定目的蛋白，分析發(fā)現(xiàn)與預期外源目的基因表達產物相當的37KD左右增加了一條特異蛋白條帶，且目的蛋白是以可溶的形式表達，凝膠成像儀分析其表達量高達27.9％。用親和層析分離純化后的ProTα融合蛋白作為抗原，與完全弗氏佐

4、劑完全乳化，采用腋下多點注射免疫的方法免疫新西蘭大白兔，經過31天的免疫，獲得兔抗ProTα的多克隆抗體。采用間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法，測得抗體效價超過l：51200，蛋白印跡分析結果顯示，該抗體能特異性與ProTα原產生明顯免疫親和反應。體內抗腫瘤實驗顯示，該融合蛋白在1.0-0.0001μg/只范圍都具有明顯抑制S180在小鼠皮下的生長，尤其對已經腹水接種S180細胞的荷瘤小鼠再皮下注射重組融合蛋白，0.0001μg/只的

5、濃度并具有顯著延長小鼠壽命的效果，尤其是1μg只濃度以上的劑量即可達到超過60天，并且完全存活的效果。在抗氧化能力活性檢測中，選擇4個月齡，體重在40克以上的老齡老鼠進行實驗，通過注射重組融合蛋白，不僅可以顯著提高老鼠的胸腺指數，同時可以顯著提高老鼠抗氧化能力。本研究采用GST原核表達系統(tǒng)克隆表達融合蛋白ProTa，制備了兔抗ProTa多克隆抗體，所制備的抗體具有很強的靈敏性和特異性，初步探索重組ProTa的抗腫瘤，抗氧化及延長荷瘤小鼠