家蠅Cecropin A基因的體外高效表達(dá)及其生物活性初步鑒定.pdf

1、抗菌肽是一種廣泛分布于自然界中具有抗菌活性的小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)，在宿主抵抗病原生物中扮演著重要的角色。目前已從生物體內(nèi)分離出多種具有抗菌活性的小分子質(zhì)量蛋白質(zhì)。這些抗菌肽表現(xiàn)出廣譜的抗菌效能，且對正常的真核細(xì)胞沒有毒性作用。更重要的是病原生物對抗菌肽不能產(chǎn)生耐藥性。因此，抗菌肽作為一種潛在的抗菌藥物引起人們的注意。 Cecropins是一種首先從Hyalophora cecropia血淋巴中分離得到的昆蟲抗菌肽分子，由37個(gè)氨基酸

2、殘基組成；是一類具有高效廣譜抗菌活性的小分子多肽。Cecropins在毫摩爾濃度的水平上就能殺死一些病原體，且對真核細(xì)胞毒性很小。Cecropins在受到病原體入侵或注射器皮下?lián)p傷時(shí)，由脂肪體和血淋巴合成。其殺死細(xì)菌的精確機(jī)制還不清楚，但其生物活性的作用靶點(diǎn)一般認(rèn)為是細(xì)胞膜。目前，Cecropins對細(xì)胞膜的作用機(jī)制，主要是通過利用人工液態(tài)小囊、細(xì)菌和人造膜來研究。 在人工液態(tài)小囊的研究中，Cecropin A的生物活性依賴于其

3、濃度。Cecropin A分子相對于脂質(zhì)分子的比率較小時(shí)，可以形成小的離子通道；Cecropin A分子相對于脂質(zhì)分子的比率較大時(shí)，形成的穿膜通道可以通過較大的探針分子。但是，不同Cecropin A濃度對于陰離子脂質(zhì)體、中性膜結(jié)構(gòu)的活性都是一樣的。同時(shí)，細(xì)胞膜中的膽固醇并不能阻止Cecropin A形成離子通道，但可以阻止大通道的形成，防止較大的探針分子通過膜結(jié)構(gòu)。在利用小囊的研究中，人們確定膽固醇和陰離子脂質(zhì)體均不對Cecropin

4、 A的活性產(chǎn)生影響。 采用紅外線波譜分析技術(shù)，分析Cecropin A對細(xì)胞膜的作用，可以更好的理解多肽在細(xì)胞膜上的活性。Cecropin A通過接近、粘附于細(xì)胞膜上，然后插入液態(tài)膜中，最終在膜中形成功能結(jié)構(gòu)。Cecropin A的主要結(jié)構(gòu)是在α-螺旋的基礎(chǔ)上形成β-結(jié)構(gòu)。α-螺旋的縱軸和β-結(jié)構(gòu)的橫軸與細(xì)胞膜表面相平行。這些發(fā)現(xiàn)猜測，Cecropin A對小囊的作用主要是由多個(gè)分子組裝成的結(jié)構(gòu)造成細(xì)胞膜缺損。 為了能夠

5、使Cecropin A作為一種可能的抗菌藥物在醫(yī)療中使用，需要其具有較低的獲取成本和大量的生產(chǎn)方式。因此在體外進(jìn)行重組表達(dá)是最理想的方法。至今，各種表達(dá)系統(tǒng)，如原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，均已被應(yīng)用到重組表達(dá)抗菌肽中。由于抗菌肽對宿主細(xì)胞的毒性作用和細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的敏感性，使上述表達(dá)系統(tǒng)對天然抗菌肽的重組表達(dá)較為困難或僅能低水平的表達(dá)。 最近幾年的研究中，將目光集中在了利用融合表達(dá)方式，在E.coli中表達(dá)蛋白質(zhì)。融

6、合表達(dá)不但可以降低抗菌肽對宿主細(xì)胞的毒副作用，并能保護(hù)其免受蛋白酶的降解。硫氧還蛋白（Thioredoxin，Trx）是一種還原酶，普遍存在于各種生物體中，其可以高水平在E.coli中表達(dá)。利用生物信息學(xué)分析Trx和Cecropin A，顯示在兩者的融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中，Cecropin A分子的部分結(jié)構(gòu)可以被Trx分子包裹。通過Trx分子對Cecropin A分子的包裹，使融合蛋白質(zhì)遮蔽Cecropin A分子的生物活性，減少其對宿主細(xì)胞

7、的毒性，可以在原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組表達(dá)。為能夠在融合蛋白質(zhì)表達(dá)后，獲得家蠅Cecropin A天然成熟肽（M. domestica mature cecropin，MC），本研究在Trx分子和Cecropin A分子之間加入色氨酸殘基，設(shè)計(jì)構(gòu)建胃蛋白酶水解位點(diǎn)，便于MC從融合蛋白質(zhì)中釋放。 融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的含量，主要由基因的轉(zhuǎn)錄水平、核糖體的翻譯效率和蛋白質(zhì)的半衰期決定。為了提高Trx＆MC融合蛋白質(zhì)在原核表達(dá)系統(tǒng)中的

8、表達(dá)量，本研究在融合蛋白質(zhì)中連入了Ubiquitin（泛素）分子。Ubiquitin是一種在真核細(xì)胞中普遍存在的高度保守的小分子蛋白質(zhì)，由76個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。其最主要的功能是標(biāo)記需要通過蛋白酶降解的蛋白質(zhì)分子，對細(xì)胞內(nèi)各種蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性起著調(diào)控作用。自身在細(xì)胞內(nèi)較為穩(wěn)定，不被細(xì)胞內(nèi)一般蛋白酶水解。Ubiquitin作為融合蛋白質(zhì)的伴侶分子已被證明在多種表達(dá)系統(tǒng)中有良好的表達(dá)。本研究在Trx&MC融合蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了Trx&Ubi

9、quitin&MC融合蛋白質(zhì)。通過在BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，比較在相同誘導(dǎo)條件下，兩種融合蛋白質(zhì)占全菌蛋白質(zhì)的比例，確定Ubiquitin分子是否能夠增加融合蛋白質(zhì)在細(xì)菌內(nèi)的穩(wěn)定性、延長蛋白質(zhì)的半衰期，增加融合蛋白質(zhì)在全菌蛋白質(zhì)中比例。 生物信息學(xué)（Bioinformatics）是一門交叉科學(xué)，它包含了生物信息的獲取、處理、存儲、分發(fā)、分析和解釋等在內(nèi)的所有方面，它綜合運(yùn)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和生物學(xué)的各種工具，來闡明和理解大

10、量數(shù)據(jù)所包含的生物學(xué)意義。其分析是建立在既往獲得的生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，是將已知知識應(yīng)用到未知領(lǐng)域的工具。其對基因、氨基酸肽鏈的分析全面、準(zhǔn)確、迅速，是傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)所不能比擬的。在實(shí)驗(yàn)前對家蠅Cecropin A氨基酸序列進(jìn)行了分析，首先明確其氨基酸肽鏈的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，確定其生物活性。同時(shí)對融合蛋白質(zhì)氨基酸肽鏈結(jié)構(gòu)的分析確定實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性，對實(shí)驗(yàn)起到了指導(dǎo)預(yù)測作用。在構(gòu)建融合蛋白質(zhì)水解位點(diǎn)時(shí)，利用計(jì)算機(jī)掃描融合蛋白質(zhì)肽鏈，查找肽鏈中存在和不存在

11、的已知各種水解位點(diǎn)，選擇構(gòu)建適當(dāng)?shù)乃馕稽c(diǎn)，避免實(shí)驗(yàn)的盲目性。通過生物信息學(xué)分析不同物種來源的Cecropin A氨基酸序列的差異性，揭示其內(nèi)在特性。 在本研究中，克隆并體外表達(dá)了來自家蠅的cecropin A基因和ubiquitin基因，證明Ubiquitin分子可以提高融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，并用抗血清鑒定Trx&MC融合蛋白質(zhì)。通過水解融合蛋白質(zhì)獲得MC，體外液態(tài)生長抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其在體外的抗菌能力。 目的：

12、 1.克隆家蠅的cecropin A與ubiquitin基因。 2.構(gòu)建pET32a-mc與pET32a-ubiquitin&mc原核表達(dá)質(zhì)粒。 3. 鑒定Ubiquitin分子對融合蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響。 4.利用家蠅血淋巴抗血清，驗(yàn)證重組蛋白質(zhì)。 5.水解純化的融合蛋白質(zhì)，獲得MC多肽，并驗(yàn)證其體外抗菌活性。 方法： 1.生物信息學(xué)分析不同物種來源Cecropin A的差異，構(gòu)建Ce

13、cropin A進(jìn)化樹，分析MC及Trx&MC的二級和三級結(jié)構(gòu)。 2.采用針刺法誘導(dǎo)抗菌肽，并用RT-PCR技術(shù)從家蠅組織中克隆cecropin A和ubiquitin基因。 3.將mc與pET32a載體連接，構(gòu)建pET32a-mc重組質(zhì)粒。 4.將ubiquitin與pET32a-mc載體相連，構(gòu)建pET32a-ubiquitin&mc重組質(zhì)粒。 5.將上述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 （DE3），IPTG誘導(dǎo)

14、表達(dá)，并比較兩種重組質(zhì)粒蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異。 6.針刺家蠅幼蟲誘導(dǎo)抗菌肽，并收集血淋巴免疫家兔制備抗血清。 7.雙向瓊脂糖擴(kuò)散法驗(yàn)證抗血清的效價(jià)。 8.Western Blot分析重組蛋白質(zhì)的免疫反應(yīng)性。 9.純化回收pET32a-mc質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物。 10.水解融合蛋白質(zhì)，釋放MC多肽。 11.通過比較融合蛋白、MC、氨芐青霉素、LB液體培養(yǎng)基對細(xì)菌生長曲線的影響，確定其生物學(xué)活性。

15、 結(jié)果： 1.Cecropin A具有種屬間的差異。 2.MC為雙親性α螺旋結(jié)構(gòu)，Trx&MC的三級結(jié)構(gòu)顯示MC被包裹入Trx分子內(nèi)部，Trx分子可以屏蔽MC分子的生物活性，融合蛋白質(zhì)可以在原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。 3.成功克隆mc與ubiquitin基因，并構(gòu)建pET32a-mc與pET32a-ubiquitin&mc重組質(zhì)粒。 4.經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，重組蛋白質(zhì)主要以可溶形式表達(dá)。 5.兩

16、種表達(dá)質(zhì)粒在BL21 （DE3）宿主菌中，相同條件下pET32a-ubiquitin&mc質(zhì)粒蛋白質(zhì)表達(dá)量高于pET32a-mc質(zhì)粒。 6.家蠅幼蟲血淋巴免疫家兔制備抗血清，獲得血淋巴抗血清。 7.Western Blot結(jié)果顯示pET32a-mc質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物與多抗血清具有特異的免疫反應(yīng)性。 8.融合蛋白質(zhì)經(jīng)純化后水解，將MC釋放。 9.通過細(xì)菌液態(tài)生長抑制實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證體外表達(dá)的MC具有抑制細(xì)菌生長的作用，

17、無殺菌作用。 結(jié)論： 1.Cecropin A分子具有種屬間的差異，但也具有高度保守的區(qū)域，氨基酸殘基的組成對其活性影響不大，生物學(xué)活性主要由其空間結(jié)構(gòu)和氨基酸殘基的特性決定。 2.采用融合表達(dá)的方法可以在原核宿主菌中表達(dá)毒性蛋白質(zhì)。 3.Ubiquitin分子可以提高融合蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，增加融合蛋白質(zhì)的表達(dá)量。 4.體外表達(dá)的MC具有明顯的抑制細(xì)菌生長的能力，但不能殺死液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌