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文檔簡介
1、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)是促胰液素/胰高血糖素家族的成員,它在脊椎動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中發(fā)揮著多種生理功能。PACAP能有效地促進(jìn)魚類生長激素(Growth hormone,GH)和促性腺激素(Gonadotropin,GTH)的分泌,進(jìn)而調(diào)節(jié)魚類的生長和生殖。近年來,PACAP38作為新型生長激素釋放因子(gro
2、wth hormone-releasing factor,GRF)在魚類研究中受到越來越多的關(guān)注。本研究旨在建立大規(guī)模制備低成本、高活性的草魚PACAP38的方法。根據(jù)大腸桿菌密碼偏好性設(shè)計(jì)了3條寡核苷酸片段,并用兩步PCR的方法合成草魚PACAP38的開放性閱讀框(open reading frame,ORF),分別克隆至pThioHis A和pET32a(+)載體,構(gòu)建Top10-pThioHisA-PACAP38、BL21(DE3
3、)-pThioHisA-PACAP38和BL21(DE3)-pET32a(+)-PACAP38三種表達(dá)系統(tǒng),其中BL21(DE3)-pET32a(+)-PACAP38為最佳表達(dá)系統(tǒng)。用該表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模制備的Thioredoxin-PACAP38(Trx-PACAP38)融合蛋白85％以上為可溶性蛋白,融合蛋白占可溶性總蛋白的36%;1LE.coliBL21(DE3)菌液中含有123mgTrx-PACAP38融合蛋白,經(jīng)Ni2+親和層析柱
4、純化獲得99mg97%純度的Trx-PACAP38融合蛋白。與融合伴侶對(duì)照組相比較,純化得到的Trx-PACAP38融合蛋白能特異性抑制T98G人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖,而PACAP抗體能中和該效應(yīng),證明重組草魚PACAP38具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的生物學(xué)活性。本研究成功建立了一種表達(dá)和純化重組草魚PACAP38的方法,可以為一些重要小肽的生產(chǎn)提供借鑒。純化獲得的重組草魚PACAP38不僅有助于魚類養(yǎng)殖,而且有助于魚類生長與生殖功能的基礎(chǔ)性研究
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