PACAP及其衍生物的克隆、表達(dá)、純化和生物學(xué)活性研究.pdf

1、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP)是血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)/促胰液腺素/胰高血糖素/生長(zhǎng)激素釋放激素家族的一員，與VIP有68％的同源性。同VIP一樣，PACAP是一種多效性多肽，其生物學(xué)功能涉及機(jī)體9大系統(tǒng)，而且對(duì)糖尿病、肥胖、高血壓、哮喘、帕金森等疾病的治療有一

2、定的積極作用。然而，PACAP的體內(nèi)半衰期較短(約5～10min)，且目前針對(duì)這一問(wèn)題的研究較少，并都需要進(jìn)行體外化學(xué)修飾，操作繁瑣、所得衍生物活性受限。因此，本研究對(duì)PACAP的氨基酸序列進(jìn)行改造，在其羧基端末尾添加半胱氨酸，擬使其能與機(jī)體血清白蛋白結(jié)合，抑制可能存在的降解行為，提高體內(nèi)穩(wěn)定性；并用基因工程技術(shù)制備PACAP及其衍生物，降低研究成本；此外，本研究還通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探究了PACAP及其衍生物在抗肥胖、抗腫瘤和降

3、血糖方面的活性。
　　 本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果概述如下：
　　 1)PACAP及其衍生物的克隆、表達(dá)、純化
　　 對(duì)GenPept報(bào)道的PACAP(包括PACAP38和PACAP27)的氨基酸序列進(jìn)行改造，將改造衍生物命名為cPACAP(cPACAP38和cPACAP27)；人工合成cPACAP38的堿基序列后，PCR擴(kuò)增PACAP38、PACAP27和cPACAP27的基因序列；為使目的多肽與硫氧還蛋白(Trx

4、)融合表達(dá)，采用克隆技術(shù)將目的基因插入表達(dá)載體pET32a(+)中，獲得4種表達(dá)質(zhì)粒后分別轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，得到4種表達(dá)菌株--BL21-pET32a(+)-PACAP38、BL21-pET32a(+)-cPACAP38、BL21-pET32a(+)-PACAP27、BL21-pET32a(+)-cPACAP27。
　　 表達(dá)菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)融合蛋白，共4種--Trx-PACAP38、Trx-cPACAP

5、38、Trx-PACAP27、Trx-cPACAP27，其表達(dá)量分別為22.1％、24.6％、47.3％、47.7％，可溶性融合蛋白占表達(dá)量的百分比分別為48.7％、54.0％、88.3％、66.6％。
　　 將IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的菌液超聲破碎后，經(jīng)兩次鎳離子螯合親和層析，得到4種目的多肽--PACAP38、cPACAP38、PACAP27、cPACAP27，得量分別為1.6mg、1.8mg、9.1mg、5.7mg，ImageJ軟

6、件掃描純度均在95％以上。
　　 2)PACAP及其衍生物的活性測(cè)定與比較
　　 采用小鼠飲食抑制實(shí)驗(yàn)，對(duì)基因工程制備的PACAP及其衍生物進(jìn)行活性測(cè)定和比較。結(jié)果表明，不同劑量的4種目的多肽對(duì)小鼠飲食均有抑制作用，而且cPACAP38與cPACAP27的活性明顯比PACAP38與PACAP27強(qiáng)，cPACAP38的效果能持續(xù)12h仍有顯著性差異，cPACAP27也能維持12h有統(tǒng)計(jì)意義。表明與天然PACAP相比，衍生物

7、cPACAP的體內(nèi)活性更穩(wěn)定、效果更持久。
　　 3)PACAP及其衍生物生物學(xué)活性探究
　　 長(zhǎng)期給藥觀察PACAP38及cPACAP38的抗肥胖效果。連續(xù)10天給小鼠腹腔注射PACAP38和cPACAP38，結(jié)果顯示，小鼠體重、糖耐量及體內(nèi)肥胖相關(guān)指標(biāo)如甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和膽固醇等并沒(méi)有明顯變化。
　　 用MTT比色分析法檢測(cè)不同濃度PACAP27和cPACAP27對(duì)人乳腺癌細(xì)胞Bcap37

8、、人肝癌細(xì)胞BEL7404、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y、人肺痛細(xì)胞A549增殖活性的影響，結(jié)果未顯示出調(diào)控作用。
　　 用腹腔糖耐量及降糖藥效法分析PACAP27和cPACAP27對(duì)GLP-1降糖活性的影響。發(fā)現(xiàn)，將PACAP27及cPACAP27與GLP-1混合后給小鼠注射，其降糖效果更明顯，給藥劑量為10nmol/kg時(shí)，混合給藥組的降糖效果能持續(xù)1.5h，是單獨(dú)GLP-1給藥組的3倍，提示PACAP對(duì)GLP-1的降糖