重組精氨酸脫亞胺酶的表達(dá)、純化、復(fù)性及其生物活性研究.pdf

1、通過(guò)氨基酸降解酶來(lái)降解氨基酸治療癌癥，目前取得的進(jìn)展比較有限。在臨床上，只有L-天門(mén)冬氨酸酶被用來(lái)治療淋巴細(xì)胞白血病，以及一些亞型的的非Hodgkin氏淋巴瘤。利用氨基酸降解來(lái)治療癌癥的有效性不僅依賴(lài)于酶的性質(zhì)，比如，特異的酶活性、合適的pH值、酶的穩(wěn)定性，還取決于目標(biāo)細(xì)胞對(duì)于缺失該種氨基酸的敏感性。然而，用L-天門(mén)冬氨酸酶來(lái)治療癌癥卻有不少的副反應(yīng)，包括過(guò)敏性休克、凝血癥狀以及肝和胰腺的中毒癥狀。另外，對(duì)于某些病人，這種酶的療效也不太

2、明顯。因此，這就需要尋找另外一種酶來(lái)代替L-天門(mén)冬氨酸酶用于癌癥的治療。 精氨酸脫亞胺酶(Arginine deiminase,ADI)，能夠降解精氨酸為瓜氨酸和氨水。該酶存在于很多種類(lèi)的微生物中。L-精氨酸是哺乳動(dòng)物細(xì)胞很重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，它也被支原體用作主要的非糖酵解能量來(lái)源。 從被支原體感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中得到的精氨酸脫亞胺酶(Argininedeiminase,ADI，EC 3.5.3.6)已被證明含有重要的抑制

3、腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)以及抗血管生成活性。在本實(shí)驗(yàn)中，我們利用克隆的ADI在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白，得到的ADI重組蛋白通過(guò)離子交換層析純化并進(jìn)一步復(fù)性。復(fù)性后的重組ADI蛋白經(jīng)分析與天然ADI蛋白具有相近的分子量(大約46KD)和相似的酶活性(～38U/mg)，可以將L-精氨酸轉(zhuǎn)換成瓜氨酸。在蛋白酶降解實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)重組ADI具有比天然ADI更穩(wěn)定的抗胰蛋白酶降解活性，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)重組ADI的半衰期比天然ADI更長(zhǎng)。進(jìn)一步的研究，我們發(fā)

4、現(xiàn)重組ADI能抑制腫瘤細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)，同時(shí)具有抑制HepG2細(xì)胞遷移的作用。 有很多實(shí)驗(yàn)室報(bào)道過(guò)純化精氨酸脫亞胺酶的方法，但這些純化方法有不少的弊端，例如純化步驟較多，純化方法不合理等。純化步驟越多，則由于每步純化都不可避免造成目的蛋白的損失，從而引起蛋白回收率的下降，再加上較多的步驟，每個(gè)純化周期時(shí)間也就勢(shì)必延長(zhǎng)，這樣，整個(gè)純化蛋白的成本就相應(yīng)比較高。純化方法的不合理，主要是因?yàn)橹亟M精氨酸脫亞胺酶一般是以無(wú)蛋白活性的包

5、涵體形式表達(dá)，蛋白復(fù)性這一步就比較關(guān)鍵，報(bào)道過(guò)的純化方法一般是先稀釋復(fù)性然后再純化，而稀釋復(fù)性后的蛋白濃度很低，在濃縮蛋白時(shí)以及后面的純化過(guò)程中由于精氨酸脫亞胺酶的不穩(wěn)定性，很容易引起酶蛋白的活性損失。我們的實(shí)驗(yàn)中，只用一步離子柱純化蛋白然后在合適的緩沖液中透析使蛋白復(fù)性，這樣既節(jié)約了時(shí)間、成本，又最大限度地保持了酶蛋白的活性。 癌癥目前越來(lái)越成為威脅人類(lèi)健康的主要疾病，人們也在尋找各種抗癌的方法，其中精氨酸脫亞胺酶的抗癌活性