絞股藍(lán)皂甙調(diào)控山羊瘤胃甲烷生成的時(shí)間效應(yīng)及作用機(jī)制的研究.pdf

1、全球暖化是嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題之一，其主要原因是大氣中二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)和一氧化二氮(N2O)等溫室氣體濃度的不斷增加。甲烷是一種強(qiáng)烈的溫室氣體，雖然甲烷在空氣中的含量低于二氧化碳，但是甲烷造成全球暖化的影響作用是二氧化碳的20～30倍。飼料在反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)被各種微生物發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷不能被動(dòng)物利用，而是以噯氣的方式排出體外，這不僅會(huì)加劇溫室效應(yīng)，而且還會(huì)造成2-15％飼料總能量的損失。因此，采取措施減少動(dòng)物源甲烷的排放將有助于

2、緩解全球氣候變暖，同時(shí)還可以降低瘤胃發(fā)酵的能量損失，提高飼料利用率。近幾十年來(lái)，由于抗生素等飼料添加劑的廣泛使用嚴(yán)重危害畜禽和人類健康，植物提取物作為一種抗生素替代品在畜禽養(yǎng)殖上越來(lái)越受到重視。很多研究者發(fā)現(xiàn)，皂甙類物質(zhì)具有調(diào)節(jié)瘤胃微生物發(fā)酵、抑制原蟲(chóng)數(shù)量、降低甲烷產(chǎn)量等作用。但是，這些研究都基于短期的在體試驗(yàn)或體外發(fā)酵試驗(yàn)的結(jié)果，皂甙對(duì)甲烷生成的抑制作用是否能長(zhǎng)期存在，是否具有作為綠色添加劑長(zhǎng)期開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值尚未清楚。此外，研究還發(fā)現(xiàn)

3、皂甙對(duì)甲烷生成的抑制作用與日糧精粗比有關(guān)，盡管這方面的報(bào)道結(jié)果并不一致。為此，本論文首先通過(guò)體外試驗(yàn)研究不同精粗比條件下絞股藍(lán)皂甙對(duì)甲烷生成的抑制作用。其次，在該研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)長(zhǎng)期瘤胃灌注絞股藍(lán)皂甙，研究其對(duì)瘤胃甲烷生成、發(fā)酵特性及菌群作用的時(shí)間效應(yīng)。最后，通過(guò)體外多次傳代試驗(yàn)，對(duì)絞股藍(lán)皂甙抑制甲烷生成的作用機(jī)制和瘤胃菌群對(duì)絞股藍(lán)皂甙的耐受性進(jìn)行進(jìn)一步探討。
　　1不同精粗比條件下添加絞股藍(lán)皂甙對(duì)瘤胃體外甲烷生成、發(fā)酵特性及微

4、生物區(qū)系和數(shù)量的影響
　　本試驗(yàn)以羊草、玉米和豆粕的混合物為底物，采用體外產(chǎn)氣量法研究不同精粗比條件下，絞股藍(lán)皂甙對(duì)甲烷產(chǎn)量、發(fā)酵特性及微生物區(qū)系和數(shù)量的影響。試驗(yàn)采用2×2雙因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即2個(gè)底物精粗比(玉米和豆粕∶羊草=70∶30和30∶70）和2個(gè)絞股藍(lán)皂甙添加量（0mg和16mg）。瘤胃液取自3只安裝有永久性瘤胃瘺管的南京本地山羊。發(fā)酵2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h時(shí)，測(cè)定產(chǎn)氣量和甲烷的產(chǎn)量，并在發(fā)酵4

5、8h后采集發(fā)酵液樣品測(cè)定瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物。結(jié)果顯示，發(fā)酵過(guò)程中高粗料組的產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量均極顯著低于高精料組(P＜0.01)。高粗料底物條件下添加絞股藍(lán)皂甙顯著降低了48h的累計(jì)產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量，使甲烷產(chǎn)量降低了14.49％。但高精料底物條件下皂甙處理組和對(duì)照組之間甲烷產(chǎn)量和產(chǎn)氣量均沒(méi)有差異。不同精粗比條件下，添加絞股藍(lán)皂甙均提高了發(fā)酵液的pH值，尤其是高粗料底物條件下差異顯著（P＜0.05），但對(duì)氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度沒(méi)有顯著影響

6、。高精料底物條件下，發(fā)酵液中的各種揮發(fā)性脂肪酸的濃度在皂甙處理組和對(duì)照之間的差異不顯著。然而，在高粗料底物條件下，添加絞股藍(lán)皂甙顯著降低了發(fā)酵液乙酸濃度和略提高了丙酸濃度從而使乙酸/丙酸比例顯著降低（P＜0.05）。兩種不同精粗比條件下添加皂甙均顯著提高了發(fā)酵液丁酸的濃度。DGGE結(jié)果顯示，與高粗料組相比，高精料底物條件下，細(xì)菌和原蟲(chóng)DGGE圖譜上的有些條帶消失，而甲烷菌DGGE圖譜上多了一些條帶。但是，在不同精粗比條件下，添加絞股藍(lán)皂

7、甙對(duì)于瘤胃總細(xì)菌、原蟲(chóng)和產(chǎn)甲烷菌的區(qū)系結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的影響，無(wú)差異性條帶出現(xiàn)。定量PCR結(jié)果顯示，發(fā)酵體系中精粗比的改變顯著影響了黃化瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、真菌和原蟲(chóng)的數(shù)量（P＜0.05），但對(duì)甲烷菌和總細(xì)菌數(shù)量沒(méi)有明顯的作用。高粗料底物條件下，皂甙處理組琥珀酸絲狀桿菌和原蟲(chóng)數(shù)量顯著降低(P＜0.05)，而甲烷菌的mcrA基因數(shù)量（P＜0.10）及總細(xì)菌、真菌和黃花瘤胃球菌數(shù)量均具有下降的趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，高精料底物條件下，添加絞

8、股藍(lán)皂甙對(duì)這些微生物的數(shù)量均沒(méi)有影響。以上的結(jié)果說(shuō)明，絞股藍(lán)皂甙在高粗料底物條件下，通過(guò)抑制瘤胃中原蟲(chóng)、甲烷菌及纖維降解茵等各種微生物的數(shù)量來(lái)降低甲烷的產(chǎn)量。但是，在高粗料底物條件下添加絞股藍(lán)皂甙對(duì)甲烷產(chǎn)量及相關(guān)的微生物數(shù)量和區(qū)系沒(méi)有任何影響。
　　2瘤胃灌注絞股藍(lán)皂甙對(duì)山羊甲烷生成、瘤胃發(fā)酵特性及微生物生態(tài)變化的時(shí)間效應(yīng)和血液指標(biāo)的影響
　　本試驗(yàn)通過(guò)山羊瘤胃內(nèi)長(zhǎng)期灌注絞股藍(lán)皂甙研究絞股藍(lán)皂甙對(duì)瘤胃甲烷生成、發(fā)酵特性及微生

9、物生態(tài)的長(zhǎng)期效應(yīng)。8頭安裝有瘤胃瘺管的1歲左右本地山羊采用2×2交叉設(shè)計(jì)分成兩組。絞股藍(lán)皂甙每天的灌胃量為:對(duì)照組0g/天/頭，處理組6g/天/頭。試驗(yàn)共兩期，每期分5個(gè)階段，包括一個(gè)21天的基礎(chǔ)日糧適應(yīng)階段（第二期為交換階段）和四個(gè)21天的試驗(yàn)階段。以絞股藍(lán)皂甙灌注量與不同階段作為主要因子，研究瘤胃灌注絞股藍(lán)皂甙對(duì)瘤胃甲烷生成、發(fā)酵特性及微生物的影響。將絞股藍(lán)皂甙在60mL生理鹽水中混勻，分兩次在8:00和17:00點(diǎn)從瘺管處灌注到瘤

10、胃里，對(duì)照組灌注相同體積的生理鹽水。日糧以山羊維持需要量配制，精粗比為3:7。從每階段的第十四天開(kāi)始，用INNOVA1412紅外光聲譜氣體監(jiān)測(cè)儀和INNOVA1309多點(diǎn)采樣儀測(cè)定甲烷產(chǎn)量。每三天記錄一次剩余料量來(lái)計(jì)算采食量，每階段的最后兩天分別在晨飼前的0h和飼喂后2h、4h、8h，利用負(fù)壓原理抽取瘤胃內(nèi)容物測(cè)定各種指標(biāo)。每一期結(jié)束后，于次日采食前0h在山羊右頸靜脈采血測(cè)定血清指標(biāo)。結(jié)果顯示，添加絞股藍(lán)皂甙對(duì)不同階段山羊干物質(zhì)采食量沒(méi)

11、有顯著的影響。與對(duì)照組相比，甲烷排放量在階段1和2分別降低了6.08％和6.76％(P＜0.05)，但是在最后兩個(gè)階段逐漸上升。整個(gè)試驗(yàn)期，絞股藍(lán)皂甙對(duì)瘤胃pH值、微生物蛋白沒(méi)有明顯的影響。但處理組的氨態(tài)氮濃度從第一階段開(kāi)始逐漸降低的趨勢(shì)（P＜0.10）。此外，丁酸、戊酸和異戊酸濃度也沒(méi)有發(fā)生顯著變化。但是，處理組各階段丙酸濃度略高于對(duì)照組。處理組的乙酸濃度在試驗(yàn)的第一階段和第二階段顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），而且在這兩個(gè)階段，乙酸

12、/丙酸比例和總揮發(fā)性脂肪酸濃度也顯著降低（P＜0.05），然而在第三和第四階段又恢復(fù)到基礎(chǔ)階段的水平。皂甙處理后異丁酸濃度降低，尤其第一階段差異顯著（P＜0.05）。瘤胃灌注絞股藍(lán)皂甙對(duì)于瘤胃總細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌和原蟲(chóng)的區(qū)系結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的影響，DGGE圖譜上沒(méi)有差異性條帶出現(xiàn)。定量PCR結(jié)果中甲烷菌的mcrA基因數(shù)量和原蟲(chóng)數(shù)量具有與甲烷產(chǎn)量相同的變化趨勢(shì)。與對(duì)照組相比，處理組甲烷菌的mcrA基因數(shù)量在第一階段和第二階段分別低于22.4％和2

13、8.04％(P＜0.10)，而處理組的原蟲(chóng)數(shù)量在第一、第二階段分別降低14.7％和12.3％(P＜0.10)，但在試驗(yàn)的第三和第四階段逐漸恢復(fù)到處理前的水平甚至更高。各階段處理組的總細(xì)菌、真菌、黃化瘤胃球菌及產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量均低于對(duì)照組，但可能因?yàn)閭€(gè)體差異導(dǎo)致較大的標(biāo)準(zhǔn)誤差，以上微生物在處理組與對(duì)照之間的差異沒(méi)有達(dá)到顯著的水平。瘤胃灌注絞股藍(lán)皂甙對(duì)血液總蛋白、總膽固醇、血糖、尿素氮、肌酐的濃度，以及谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷酰轉(zhuǎn)肽酶和乳酸脫氫

14、酶的酶活無(wú)顯著影響，說(shuō)明長(zhǎng)期灌胃絞股藍(lán)皂甙對(duì)山羊的健康沒(méi)有影響?？偠灾?，絞股藍(lán)皂甙通過(guò)抑制瘤胃中的各種微生物數(shù)量降低瘤胃內(nèi)甲烷的產(chǎn)量，而且對(duì)動(dòng)物的健康沒(méi)有負(fù)面影響，但是，在長(zhǎng)期使用絞股藍(lán)皂甙時(shí)這種抑制作用逐漸消失，可能的原因是微生物對(duì)皂甙產(chǎn)生耐受。
　　3添加不同水平的絞股藍(lán)皂甙對(duì)傳代培養(yǎng)中甲烷生成、發(fā)酵參數(shù)和重要微生物區(qū)系和數(shù)量的影響
　　本試驗(yàn)采用體外多次傳代培養(yǎng)及產(chǎn)氣量法，體外研究不同水平的絞股藍(lán)皂甙對(duì)瘤胃甲烷生成、

15、發(fā)酵特性及微生物區(qū)系和數(shù)量變化的影響。試驗(yàn)根據(jù)絞股藍(lán)皂甙的添加量（0、8、16和24mg/100mL）分為4組。發(fā)酵瓶中的底物為羊草、玉米與豆粕（分別為羊草0.70g、玉米0.20g和豆粕0.10g）。第一代接種物為山羊晨飼前采的10mL用4層紗布過(guò)濾的瘤胃液，后面的每代接種物依次為上代的發(fā)酵液，每次均取10mL添加皂甙前傳5代使微生物處于穩(wěn)定期，添加絞股藍(lán)皂甙后再傳5代。每個(gè)處理組設(shè)4個(gè)重復(fù)，每48h進(jìn)行一次傳代，每次傳代后的12h、

16、24h和48h測(cè)定產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量。每代發(fā)酵結(jié)束后迅速測(cè)定pH值，然后采集發(fā)酵液樣品測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，絞股藍(lán)皂甙能有效地抑制甲烷產(chǎn)量。發(fā)酵48h高劑量組（16mg和24mg）的累計(jì)產(chǎn)氣量和甲烷產(chǎn)量在第二、第三、第四代顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，而且，皂甙劑量間呈顯著和極顯著的線性效應(yīng)（P＜0.05、P＜0.01）。整個(gè)發(fā)酵期，各處理組48h的累計(jì)產(chǎn)氣量與甲烷產(chǎn)量呈先降低后上升的趨勢(shì)。高劑量處理組（16mg和24mg）48h甲烷

17、產(chǎn)量在發(fā)酵的第三代分別比對(duì)照組降低了27.70％和31.08％（最低時(shí)）差異顯著(P＜0.05)，而第五代分別降低11.91％和13.10％，但差異不顯著(P＞0.05)。經(jīng)過(guò)5代發(fā)酵，各處理組的pH值均高于對(duì)照組或相當(dāng)，但各組之間差異不顯著。除了16mg和24mg處理組氨態(tài)氮濃度在第三和第五代之間顯著的代次差異外(P＜0.01)，氨態(tài)氮和微生物蛋白濃度各處理組和對(duì)照組之間沒(méi)有顯著差異。發(fā)酵的前四代各處理組總揮發(fā)性脂肪酸濃度均低于對(duì)照組

18、，但各組之間的差異不顯著(P＞0.05)，第三、第四代皂甙劑量之間有顯著的線性效應(yīng)(P＜0.05)。在培養(yǎng)每一代各處理組的乙酸濃度均低于對(duì)照組，尤其是高劑量處理組（16mg和24mg）與對(duì)照組之間在培養(yǎng)第二、第三和第四代具有顯著的差異(P＜0.05)，而且不同劑量間有顯著的線性效應(yīng)(P＜0.05)。各組之間丙酸和戊酸濃度沒(méi)有發(fā)生規(guī)律性變化。各處理組乙酸/丙酸比例在培養(yǎng)第二、第三和第四代顯著降低，而且不同劑量間有顯著的線性效應(yīng)(P＜0.0

19、5)，第四代不同劑量間有顯著的二次方效應(yīng)（P＜0.05）。雖然差異不顯著，高劑量處理組（16mg和24mg）的丁酸濃度均高于對(duì)照組和低劑量處理組(8mg)，而異丁酸和異戊酸濃度均低于對(duì)照組和低劑量處理組。DGGE分析結(jié)果表明，24mg處理組甲烷菌DGGE圖譜上的很多優(yōu)勢(shì)條帶在第三、第四代逐漸消失，但在第五代又出現(xiàn)了許多優(yōu)勢(shì)條帶，但瘤胃總細(xì)菌的DGGE圖譜上無(wú)差異性條帶出現(xiàn)。定量PCR結(jié)果顯示，高劑量處理組（16mg和24mg）甲烷菌的m

20、crA基因數(shù)量在第二、第三代急劇降低，與對(duì)照組之間有顯著差異(P＜0.05)，而且皂甙添加量之間具有顯著(P＜0.05)和極顯著(P＜0.01)的線性效應(yīng)，但是，從第四代開(kāi)始呈現(xiàn)逐漸回升的趨勢(shì)，第五代時(shí)各組之間的差異不再顯著（P＞0.05）。各處理組總細(xì)菌數(shù)量均低于對(duì)照組，但是差異不顯著(P＞0.05)，第三代在不同添加量之間有顯著的線性效應(yīng)(P＜0.05)。培養(yǎng)每一代，各處理組黃化瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌的數(shù)量均低于對(duì)照組，其高劑量