Klotho對血小板生成及功能的調控作用與機制研究.pdf

1、血小板在生理病理過程中發(fā)揮著非常重要的作用。血小板最主要的功能是參與凝血和止血。當體內血小板水平顯著降低時，如急性放射病，會導致機體出血和感染;相反，當血小板水平過高或血小板過度活化時，則會引發(fā)血栓性疾病。
　　血小板是由骨髓中的巨核細胞產生。血小板的生成經歷了造血干細胞定向分化為巨核細胞、巨核祖細胞擴增、巨核細胞分化成熟、多倍體形成、向血管竇的遷移及與內皮細胞的粘附、向血管竇伸出血小板前體及血小板產生和釋放等階段。我們前期研究發(fā)

2、現(xiàn)，巨核細胞生成血小板受到微環(huán)境中活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)水平調控。值得關注的是，ROS也是電離輻射損傷的主要介導因子，電離輻射可以誘導ROS大量產生，通過與細胞生物大分子結合而氧化損傷細胞，從而導致細胞凋亡或壞死。電離輻射后外周血細胞的大幅度降低與骨髓內造血細胞大量凋亡壞死有關。血小板減少是骨髓放射損傷后的主要表現(xiàn)之一，也是導致機體出血、感染乃至死亡的重要原因。因此，阻斷電離輻射誘導的巨核

3、祖細胞凋亡可以預防或減輕電離輻射后血小板減少癥的發(fā)生，防治出血及感染。
　　Klotho是一種主要由腎小管上皮細胞合成分泌的抗衰老蛋白。作為一種激素樣蛋白，Klotho能夠通過血液循環(huán)到達全身組織臟器，從而發(fā)揮廣泛抗衰老作用。Klotho抗衰老作用與其強大的抑制活性氧生成及清除活性氧能力有關。研究證實，Klotho可以有效預防氧化應激誘導的內皮細胞和腎細胞凋亡。由于正常情況下血小板的生成及放射損傷所致血小板減少都與氧化應激有關，所

4、以，Klotho是否能夠參與血小板的生成調控和防治放射損傷引起的血小板減少，值得深入研究。
　　另一方面，ROS在血小板活化過程中也發(fā)揮著關鍵作用。除了外源性ROS，血小板內的ROS及其下游信號通路在血小板激活、血小板與血管壁的粘附、血小板的募集與聚集及血栓形成中發(fā)揮重要的作用。某些疾病情況下，血小板異?；罨３黾友ㄐ纬傻娘L險，從而導致缺血性疾病如心肌梗死、腦卒中的發(fā)生。但是，目前預防血小板活化和血栓形成的有效措施有限。研究

5、證實，Klotho水平和功能與血栓形成疾病的發(fā)病風險呈高度負相關，同時，以血液循環(huán)中Klotho水平嚴重降低為特征的疾病-慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)常常并發(fā)血小板功能改變，提示Klotho作為一種抗氧化劑也可能會影響血小板的活化過程。
　　因此，為了探討Klotho對血小板生成與功能的影響及其病理生理學意義，在本研究中，我們以人原代巨核細胞和人巨核祖細胞株M07e細胞為研究對象，利用細胞活性

6、分析和流式細胞術實驗，分析Klotho對巨核細胞生成血小板整個過程的影響;隨后，觀察Klotho對放射損傷所致血小板減少的防治作用及機制;最后，復制小鼠5/6腎大部切除CKD模型，采用Western blot、流式細胞術、細胞免疫熒光、激光共聚焦及體內/外血栓形成實驗，觀察Klotho對CKD情況下血小板異常活化的抑制作用及相關機制。主要研究結果和結論如下:
　　1.體外研究證實，正常情況下Klotho對巨核祖細胞的增殖、巨核細胞

7、的分化成熟及血小板的產生和釋放沒有顯著的影響作用。
　　2.亞致死劑量的電離輻射可以導致巨核祖細胞ROS過度生成、大量凋亡及血小板水平嚴重降低。輻照前給予Klotho預處理可以抑制電離輻射誘導的巨核祖細胞ROS生成及凋亡，并加速小鼠電離輻射后血小板水平的恢復，提示Klotho對電離輻射后血小板減少癥有一定的預防和救治作用。
　　3.在CKD小鼠模型中，隨著尿毒癥毒素硫酸吲哚酚(Indoxyl sulphate，IS)在體內的

8、蓄積，Klotho水平顯著下降，而血小板的活性則表現(xiàn)出異常增高。
　　4.IS在體內和體外均可誘導血小板高度活化， Klotho則能顯著抑制IS誘導的血小板活化;CKD小鼠體內Klotho水平的降低會進一步加重IS誘導的血小板異常活化及血栓形成。
　　5.體外研究結果表明，IS通過誘導血小板內ROS大量生成并激活其下游p38 MAPK信號通路來促進血小板活化及血栓形成;而Klotho可以顯著抑制IS誘導的血小板內ROS過度生

9、成及p38MAPK激活，提示Klotho抑制IS誘導的血小板異常活化和血栓形成與其所具有的突出抗氧化應激能力有關。
　　6.采用apoE-/-小鼠建立高脂血癥及CKD合并高脂血癥動物模型發(fā)現(xiàn)，IS及CKD誘導的血小板過度活化可以加速動脈粥樣硬化進展，而外源性Klotho處理可以抑制IS及CKD誘導的動脈粥樣硬化形成加速。
　　總之，通過本實驗研究，我們首次明確了Klotho作為一種內源性抗氧化蛋白，一方面可以預防電離輻射誘導