高膽固醇血癥對(duì)血小板活化功能的影響及機(jī)制探討.pdf

1、研究發(fā)現(xiàn)，血小板在動(dòng)脈粥樣硬化形成以及心血管事件的發(fā)生過程中扮演著重要的作用，血小板的活化可能導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、誘發(fā)斑塊破裂、形成急性血栓形成，最終導(dǎo)致致死性事件的發(fā)生
　　在血小板的諸多活化途徑中，ADP受體-P2Y12活化途徑最為重要。當(dāng)ADP作用于P2Y12受體，進(jìn)一步激活下游的磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及抑制腺苷酸環(huán)化酶(Adenylyl Cyclase，AC)，后者進(jìn)一步下調(diào)胞內(nèi)cAMP，導(dǎo)致血管舒張劑刺激磷

2、蛋白(Vasodilator Stimulated phosphoprotein，VASP)去磷酸化，VASP在血小板的構(gòu)型改變及肌動(dòng)蛋白介導(dǎo)的骨架重組中發(fā)揮重要作用，并影響血小板的伸展及聚集作用。另一方面活化的PI3K使Akt磷酸化，最終導(dǎo)致終末信號(hào)產(chǎn)物GPⅡb/Ⅲa的激活與表達(dá)，并啟動(dòng)血小板聚集及動(dòng)脈血栓形成。
　　眾多研究提示，高脂血癥導(dǎo)致血小板活化。低密度脂蛋白膽固醇(low-densitylipoprotein chol

3、esterol，LDL-C)可通過不同的途徑激活血小板的功能。但目前臨床高低密度脂蛋白膽固醇血癥（高LDL-C）對(duì)血小板活化功能的影響及具體機(jī)制仍未明確。高LDL-C對(duì)ADP受體-P2Y12活化途徑的作用尚不清楚。
　　目的：
　　1.探討高LDL-C對(duì)血小板活化功能的影響以及他汀類藥物的干預(yù)作用
　　2.初探高LDL-C對(duì)血小板P2Y12受體后途徑的影響。
　　3.分析高LDL-C合并低高密度脂蛋白膽固醇(hi

4、gh-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)對(duì)血小板活化功能的影響
　　方法：
　　1.血小板的提取制備
　　早晨、空腹、靜息狀態(tài)下，取21G粗針于肘部靜脈取血10ml，采用1∶9右旋枸櫞酸ACD抗凝以備血小板活化功能檢測(cè)。另采用血漿管以備血脂、生化檢測(cè)。分離少血小板血漿(Platelet Poor Plasma，PPP)。將PRP血小板終濃度調(diào)整至3.0x105/ul。
　

5、　2.血脂檢測(cè)
　　總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、HDL-C、LDL-C的測(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書指示于Hitachi7600 Automatic Biochemical Analyzer檢測(cè)。
　　3.血小板聚集率的測(cè)定采用血小板聚集儀，以PPP為參比，37C恒溫恒速磁力攪拌下(1000 rpm)描記基線，將ADP10μmol/L加入PRP以誘導(dǎo)人血小板聚集，并分析血小板最大聚集率(Maximal Platelet Ag

6、gregation，MPAG％)。
　　4.全血流式細(xì)胞法檢測(cè)血小板表面活化受體標(biāo)志物
　　本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用血小板活化檢測(cè)試劑:CD62p-PE抗體、PAC-1-FITC抗體、CD42b-APC抗體，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。樣本采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，最終得出抗體熒光百分率。
　　5.血小板內(nèi)p-Akt與p-VASP的測(cè)定
　　將PRP離心以分離血小板，裂解和標(biāo)準(zhǔn)制備后行蛋白電泳轉(zhuǎn)印。電泳結(jié)束后，采用蛋白質(zhì)全濕轉(zhuǎn)膜法進(jìn)

7、行轉(zhuǎn)膜。最后暗箱曝光，顯像，定影。以PhotoshopCS4計(jì)算條帶面積分析p-Akt及p-VASP的水平。
　　結(jié)果：
　　第一部分:高LDL-C對(duì)血小板活化指標(biāo)的影響及他汀類藥物干預(yù)后的改善作用
　　本研究納入納入33例高LDL-C患者及35例血脂正常對(duì)照志愿者。高LDL-C組血小板最大聚集率高于正常對(duì)照組，但未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異標(biāo)準(zhǔn)(33.03±15.87％vs29.05±17.75％，P＞0.05);高LDL-C

8、組血小板表面CD62p及PAC-1的表達(dá)高于正常對(duì)照組，分別為1.72±0.96％ vs0.90±0.77％，P＜0.001及4.33±2.42％ vs2.63±2.03％，P＜0.01。他汀類藥物干預(yù)前后，血小板最大聚集率分別為33.03±15.87％vs26.73±9.91％，P=0.073。血小板表面CD62p及PAC-1的表達(dá)分別為1.72±0.96％vs0.85±0.72％,P＜0.001及4.33±2.42％ vs1.50±

9、1.07％,P＜0.001。
　　第二部分:高LDL-C對(duì)血小板活化指標(biāo)的機(jī)制初探
　　本研究中，在體外ADP誘導(dǎo)下，高LDL-C組血小板最大聚集率大于正常對(duì)照組，雖然未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn)(33.03±15.87％ vs29.05±17.75％，P＞0.05)。高LDL-C組血小板在ADP誘導(dǎo)下血小板P2Y12受體下游最終信號(hào)產(chǎn)物PAC-1的表達(dá)高于正常對(duì)照組，并具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(69.26±12.23％ vs62.60±1

10、1.72％，P＜0.05)。體外實(shí)驗(yàn)中，在ADP誘導(dǎo)下高LDL-C患者血小板內(nèi)p-Akt表達(dá)與正常對(duì)照組相比，組間灰度值分別為:6116.33±1488.62 vs3679.00±438.59，P=0.049。ADP誘導(dǎo)下高LDL-C患者血小板內(nèi)p-VASP表達(dá)與正常對(duì)照組，組間灰度值分別為:7855.66±793.69 vs6349.00±890.20, P=0.094。
　　第三部分:高LDL-C合并低HDL-C對(duì)血小板活化功

11、能的影響
　　本研究共納入62例高LDL-C患者，剔除14例失訪患者，故共有48例患者完成完整終點(diǎn)信息隨訪，分別為高LDL-C合并正常HDL-C組共25例，高LDL-C合并低HDL-C組共23例。同時(shí)，本研究共招募35例血脂正常對(duì)照志愿者。高LDL-C合并正常HDL-C組和高LDL-C合并低HDL-C組患者在服用他汀類藥物治療后，TC、TG、LDL-C、HDL-C均明顯下降。
　　高LDL-C合并低HDL-C患者血小板最大聚

12、集率與高LDL-C合并正常HDL-C患者及血脂正常對(duì)照志愿者比較，分別為:29.05±17.75％，31.54±15.12％，37.15±18.85％，P=0.222。高LDL-C合并正常HDL-C組血小板CD62p及PAC-1的表達(dá)與血脂正常對(duì)照組比較，分別為1.62±1.01％ vs0.90±0.77％，P=0.004及4.21±2.50％ vs2.63±2.03％，P=0.014。高LDL-C合并低HDL-C組的血小板活化標(biāo)志物C

13、D62p及PAC-1的表達(dá)與高LDL-C合并正常HDL-C組，分別為2.60±1.19％vs1.62±1.01％，P=0.004及5.90±2.58％ vs4.21±2.50％，P=0.026。高LDL-C血小板活化標(biāo)志物與血脂相關(guān)分析中發(fā)現(xiàn)高LDL-C患者HDL-C水平與血小板活化標(biāo)志物CD62p與PAC-1的表達(dá)均有顯著負(fù)相關(guān)(分別r=0.195，P=0.002及r=0.431，P=0.034)。在高LDL-C患者中血小板CD62p

14、及PAC-1的表達(dá)與指標(biāo)LDL-C∶HDL-C具有正相關(guān)并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別r=0.345，P=0.001及r=0.395，P=0.024)。
　　采用他汀類藥物治療后，高LDL-C患者血小板最大聚集率具有顯著的下降。在采用他汀類藥物治療后，高LDL-C患者血小板活化指標(biāo)均顯著性下降（高LDL-C合并低HDL-C組血小板CD62p:2.60±1.19％ vs1.51±1.67％，P＜0.01，血小板PAC-1:5.90±2.58％

15、 vs2.33±1.57％，P＜0.001及高LDL-C合并正常HDL-C組血小板CD62p:1.62±1.01％ vs0.88±0.74％，P＜0.01，血小板PAC-1:4.21±2.50％ vs1.36±1.02％，P＜0.001）。
　　高LDL-C合并低HDL-C患者在經(jīng)過他汀類藥物治療后，血小板活化指標(biāo)CD62p及PAC-1的表達(dá)依然大于高LDL-C合并正常HDL-C組（分別為血小板PAC-1:2.33±1.57％ v

16、s1.36±1.02％,P=0.0201，血小板CD62p:1.51±1.67％ vs0.88±0.74％，P=0.116)。
　　結(jié)論：
　　1.高LDL-C激活血小板功能。ADP-P2Y12受體后途徑在高LDL-C活化血小板中起著重要的作用。
　　2.高LDL-C合并低HDL-C進(jìn)一步活化血小板功能。
　　3.高LDL-C合并低HDL-C組患者在經(jīng)過他汀類藥物治療后，其血小板活化功能依然大于高LDL-C合并正