促血小板生成素(TPO)的心臟保護(hù)作用研究.pdf

1、促血小板生成素(TPO)是調(diào)節(jié)血小板/巨核細(xì)胞系的最主要蛋白因子[1],它自1958年被Kelemen[2]等人提出以來,一直被認(rèn)為功能僅局限于造血系統(tǒng)。近年來的研究新發(fā)現(xiàn)TPO也有造血外作用。TPO能促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[3],調(diào)節(jié)卵巢的增殖、調(diào)亡和分泌活動(dòng)[4],減緩缺血缺氧腦組織的損傷程度[5]。但TPO是否有心血管作用,目前尚未見諸報(bào)道。
　　2005年Yang等證實(shí)TPO能對(duì)抗神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[5],抗凋亡途徑由胞內(nèi)Akt介

2、導(dǎo)實(shí)現(xiàn)[5]。TPO能結(jié)合紅系祖細(xì)胞表面EPO受體,誘導(dǎo)有絲分裂[6]。心肌細(xì)胞表面存在EPO受體[8-9]。EPO能結(jié)合該受體,通過Akt途徑介導(dǎo)抗心肌凋亡作用[8-9]。TPO與EPO的結(jié)構(gòu)和基因序列有高度同源性,功能也極其相似[1]。此外,血管內(nèi)皮細(xì)胞及膜表面存在 TPO受體(c-Mpl)的表達(dá),TPO能刺激成血管細(xì)胞增殖及向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[10],可能誘導(dǎo)損傷區(qū)域血管形成。G-CSF能動(dòng)員骨髓內(nèi)干細(xì)胞修復(fù)損傷心肌[11],TP

3、O能增強(qiáng)內(nèi)源性G-CSF的動(dòng)員能力[21]。所以可以推測(cè),TPO可能有心肌保護(hù)作用。本研究擬從體內(nèi)和體外建立藥物性心肌損傷模型,采用熒光探針 JC-1探測(cè)心肌凋亡率,初步探討 TPO的心肌保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　材料與方法:
　　1.材料:
　　雄性BALB/c小鼠及H9C2心肌細(xì)胞株由香港中文大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,重組TPO購自美國(guó)PeproTech公司。
　　2.方法:
　　2.1體內(nèi)動(dòng)物模型
　

4、　小鼠隨機(jī)分為三組:正常對(duì)照組(N組),阿霉素組(DOX組),TPO干預(yù)治療的阿霉素組(TPO+DOX組)。DOX組是阿霉素誘導(dǎo)的急性心肌損傷模型組。
　　2.1.1超聲心動(dòng)圖監(jiān)測(cè)
　　基礎(chǔ)狀態(tài)(即給藥前)下和注射阿霉素后第五天檢測(cè)小鼠左室心腔內(nèi)徑。心功能參數(shù)包括:左心室短軸縮短率(FS％)、每分鐘射血分?jǐn)?shù)(CO)、心率(HR)。每日心率(HR)計(jì)數(shù)以相鄰2個(gè)主動(dòng)脈多普勒血流訊號(hào)間距離推算。
　　2.1.2心臟組織H&

5、E染色
　　第五天處死小鼠,取心臟,H&E染色后根據(jù)Billingham推薦方法評(píng)價(jià)各組心肌的損傷程度。
　　2.2體外實(shí)驗(yàn) H9C2細(xì)胞用10%小牛血清的IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)。
　　2.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)
　　按照TPO濃度由低至高0、5、10、50、100ng/ml設(shè)定各濃度組,同時(shí)設(shè)訂相應(yīng)空白對(duì)照組(無任何處理),隔24小時(shí)后將5μg/ml阿霉素后各孔添加入TPO濃度組,24小時(shí)后在570nm酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上

6、檢測(cè)各組吸光度。
　　2.2.2原代心肌培養(yǎng)及心肌跳動(dòng)計(jì)數(shù)
　　新生大鼠心肌細(xì)胞切碎消化后放置DMEM*培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)。將培養(yǎng)成熟的心肌細(xì)胞集落隨機(jī)分三組:空白對(duì)照組(N組)、阿霉素組(DOX組)、TPO+DOX組。在加阿霉素前(基礎(chǔ)狀態(tài))、給藥后24小時(shí)、48小時(shí)三時(shí)段觀察細(xì)胞形態(tài)、計(jì)算40秒內(nèi)心肌細(xì)胞集落的跳動(dòng)次數(shù)。
　　2.2.3流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)凋亡
　　利用熒光探針JC-1檢測(cè)線粒體跨膜電位,檢測(cè)各組凋亡率和

7、早期凋亡的通路。
　　3.結(jié)果:
　　3.1體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　3.1.1 DOX組心功能下降,第五天FS%平均值44.2±7.1%,CO平均值3.9±2.0ml/min,TPO+DOX組心功能有明顯改善,第五天FS%平均值53.7±6.4%,CO平均值5.7±2.1ml/min。五天內(nèi)DOX組心率未出現(xiàn)明顯的代償,第四天心率為539±57%,而TPO+DOX組心率出現(xiàn)明顯代償,第四天心率平均值為698±30%。

8、r>　　3.1.2第五天組織學(xué)Billingham評(píng)分。N組、TPO+DOX組、DOX組組織學(xué)中位數(shù)依次為0、2、2.5,TPO+DOX組心肌損傷程度明顯減輕。
　　3.1.3給藥后8內(nèi),TPO+DOX組的存活率明顯高于DOX組(Kaplan-Meier過程,P<0.01)。
　　3.2體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　3.2.1 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示DOX組H9C2存活率降至73.80±1.09(%),5、10、50、100ng/ml

9、TPO濃度的存活率依次為77.9±4.08、82.3±5.36、84.6±3.59、85.6±4.43(%)。
　　3.2.2第48小時(shí)DOX組原代心肌細(xì)胞集落跳動(dòng)百分比是15.2±8.4%,TPO+DOX組是47.8±11.4%。
　　3.2.3流式細(xì)胞儀檢查顯示TPO能減少H9C2細(xì)胞的凋亡數(shù)量。DOX組的凋亡率為17.8±8.8%,DOX+TPO組的凋亡率僅11.3±6.36%。
　　4.結(jié)論:
　　4.1