促血小板生成素(TPO)抗化學(xué)性缺氧對(duì)PC12細(xì)胞保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的:
　　研究重組人促血小板生成素(recombinant human thrombopoietin,rhTPO)在大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)化學(xué)性缺氧的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。為臨床上治療缺血缺氧性腦損傷尋求更為有效的治療措施和提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.用化學(xué)缺氧劑氯化鈷(CoCl2)模擬PC12細(xì)胞化學(xué)性缺氧,應(yīng)用重組人促血小板生成素建立抗CoCl2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)模型;

2、>　　2.應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽比色法(3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑,MTT)進(jìn)行細(xì)胞毒性的判斷,檢查PC12細(xì)胞的存活率;
　　3.AnnexinⅤ/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡;
　　4.細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測(cè):活性氧檢測(cè)試劑盒(Reactive Oxygen Species Assay Kit),利用熒光探針 DCFH-DA染色熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧自由基（Reactive Oxygen

3、Species,ROS)的含量。
　　5.線粒體膜電位的檢測(cè):JC-1染色,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)紅綠光的強(qiáng)度并攝片,利用軟件計(jì)算出各視野紅綠光的比值;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜電位的變化;
　　6.利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)P<0.05。
　　結(jié)果:
　　1.CoCl2抑制PC12細(xì)胞生長(zhǎng)具有濃度依賴性:化學(xué)性缺氧模擬劑CoCl2可以明顯抑制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng),MTT比色法

4、檢測(cè)顯示,CoCl2刺激濃度(200,400,600,800,1000μmol/L)分別作用PC12細(xì)胞24h后,細(xì)胞存活率顯著降低,因此,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中以500μmol/L濃度的CoCl2作用24h作為化學(xué)性缺氧的模型。
　　2.TPO可促進(jìn) PC12細(xì)胞生長(zhǎng):MTT比色法檢測(cè)顯示,25-100ng/ml濃度范圍內(nèi)干預(yù)PC12細(xì)胞48h后促進(jìn)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)且呈濃度依賴性,其中100ng/ml的TPO的保護(hù)作用最顯著。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5、,選取100ng/ml TPO作為本實(shí)驗(yàn)的保護(hù)濃度。TPO保護(hù)PC12對(duì)抗CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,經(jīng)600μmol/L濃度CoCl2處理后的PC12加入100ng/ml濃度的TPO作用48小時(shí)可以有效抑制由PC12細(xì)胞的毒性作用。故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用100ng/ml的TPO作為保護(hù)濃度。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示:500μmol/L的CoCl2引起的PC12細(xì)胞損傷再經(jīng)100ng/ml TPO處理48h后,其凋

6、亡數(shù)量有明顯減少的趨勢(shì),與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.TPO可以降低CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi) ROS生成:活性氧檢測(cè)試劑盒結(jié)果顯示,500μmol/L的CoCl2處理6小時(shí)后,細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加,而再經(jīng)100ng/ml TPO干預(yù)12h后熒光強(qiáng)度明顯減弱,但100ng/ml的TPO本身不會(huì)影響胞內(nèi)ROS的生成,結(jié)果提示TPO可以抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多。
　　5.TPO可以抑制CoCl2引起的細(xì)胞內(nèi)線粒

7、體膜電位的降低:流式細(xì)胞術(shù)JC-1染色顯示,500μmol/L的CoCl2處理24小時(shí)后,胞內(nèi)線粒體膜電位顯著降低,但經(jīng)由100ng/ml TPO干預(yù)48h,可以明顯抑制胞內(nèi)線粒體膜電位的降低。表明,TPO可通過(guò)抑制線粒體膜電位的降低來(lái)保護(hù)細(xì)胞的缺氧損傷。
　　結(jié)論:
　　1.CoCl2模擬化學(xué)性缺氧引起PC12細(xì)胞損傷,使PC12細(xì)胞存活率降低,胞內(nèi)活性氧生成增多以及細(xì)胞線粒體膜電位降低。
　　2.TPO可以對(duì)抗Co