EGCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:
　　 本研究擬采用蛋白酶體抑制劑lactacystin誘導(dǎo)PCI2細(xì)胞損傷建立帕金森病細(xì)胞模型,探討EGCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)損傷的多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　 方法:
　　 第一部分:篩選lactacystin建立帕金森病細(xì)胞模型的作用劑量
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞,設(shè)正常對(duì)照組和5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和30μmol/L4個(gè)lactacystin

2、濃度組,處理后培養(yǎng)24h,倒置顯微鏡下觀察不同濃度lactacystin對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)的影響,用MTT法測(cè)定細(xì)胞吸光度觀察lactacystin對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響,Hoechest33258熒光染色細(xì)胞核觀察lactacystin對(duì)PC12細(xì)胞細(xì)胞核的影響。
　　 第二部分:EGE6對(duì)lactacystin誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 1.了解EGCG本身對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)

3、期的PC12細(xì)胞,設(shè)正常對(duì)照組和1μmol/L、5μmaol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L6個(gè)EGCG濃度組,處理后培養(yǎng)24h,用MTT法測(cè)定細(xì)胞吸光度觀察EGCG對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響。
　　 2.EGCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞,設(shè)為正常對(duì)照組、lactacystin損傷組(終濃度為10μmol/L)

4、和EGCG預(yù)處理組。EGCG預(yù)處理組,先加入不同濃度EGCG(分別為5μmol/L、10μmol/L和50μmol/L)預(yù)處理1 h,再加入lactacystin(終濃度10μmol/L)再一起共培養(yǎng)24 h后進(jìn)行各指標(biāo)檢測(cè)。
　　 檢測(cè)指標(biāo)包括:
　　 (1)倒置顯微鏡下觀察不同濃度EGCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞形態(tài)的影響。
　　 (2)用MTT法測(cè)定細(xì)胞吸光度觀察不同濃度EGCG對(duì)la

5、ctacystin誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。
　　 (3)用核酸特異性染料Hoechest33258染色在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核形態(tài)的變化。
　　 (4)用Annexin V-FITC與PI雙標(biāo)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:Lactacystin可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷
　　 (1)Lactacystin對(duì)PC12細(xì)胞形態(tài)變化的影響
　　

6、 正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞梭型明顯,細(xì)胞分布均勻。Lactacystin組PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,梭型細(xì)胞減少,出現(xiàn)球形或橢圓形細(xì)胞。球形或橢圓形數(shù)量隨lactacystin作用劑量增加而增多。
　　 (2)Lactacystin對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響
　　 不同濃度lactacystin(5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L)作用于PC12細(xì)胞24 h后,細(xì)胞活力隨濃度增加而逐漸下降,與

7、正常對(duì)照比相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),細(xì)胞存活率分別為70.1％、59.7％、54.0％、45.8％。
　　 (3)Lactacystin對(duì)PC12細(xì)胞核形態(tài)變化的影響
　　 經(jīng)Hoechest33258染色在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常PC12細(xì)胞細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光,而lactacystin處理組部分細(xì)胞染色質(zhì)固縮,細(xì)胞核呈致密濃染,顯示較強(qiáng)熒光,甚至可見(jiàn)細(xì)胞核裂解,出現(xiàn)致密的顆粒狀熒光。
　　

8、 第二部分:EGCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用
　　 1.EGCG對(duì)PC12細(xì)胞細(xì)胞活力的影響
　　 不同濃度EGCG(1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L)與PC12細(xì)胞共培養(yǎng)24h后,與正常對(duì)照組相比,1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L EGCG處理組細(xì)胞活力無(wú)明顯變化(P〉0.05

9、)。100μmol/L、20μmol/L則使細(xì)胞活力明顯下降,與正常對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05)。
　　 2.EGCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　 (1)EGCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞形態(tài)變化的影響
　　 正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞梭型明顯,細(xì)胞分布均勻。Lactacystin組PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,梭型細(xì)胞減少,出現(xiàn)球形或橢圓形細(xì)胞。而EGCG預(yù)

10、處理組顯示細(xì)胞多為梭型,球形和橢圓形細(xì)胞較lactacystin組減少。
　　 (2)EGCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力的影響
　　 與正常對(duì)照比相比,lactacystin組細(xì)胞存活率為(61.22土1.02)％,而5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L EG-CG預(yù)處理組細(xì)胞存活率分別上升為(66.99士1.30)％、(66.67士0.65)％、(73.4±0.67)％,EGCG預(yù)處理

11、組細(xì)胞存活率隨著EGCG濃度的增加而增加,與lactacystin組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (3)EGCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞核形態(tài)的影響
　　 經(jīng)Hoechest33258染色在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常PC12細(xì)胞細(xì)胞核呈彌散均勻的藍(lán)色熒光,lactacystin處理組部分細(xì)胞染色質(zhì)固縮,細(xì)胞核呈致密濃染,顯示較強(qiáng)熒光,甚至可見(jiàn)細(xì)胞核裂解,出現(xiàn)致密的顆粒狀熒光。與lact

12、acystin組相比,ECJCG預(yù)處理后凋亡細(xì)胞比例降低,且胞核形態(tài)改善,熒光強(qiáng)度減弱。
　　 (4)EOCG對(duì)lactacystin誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡比例的影響
　　 用Annexin V-FITC與PI雙標(biāo)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示EGCG預(yù)處理組細(xì)胞的凋亡百分率降低,正常組、lactacystin組、EGCG預(yù)處理組(5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L)分別為3.0％、60.4％、59.8％、57