血管生成素與血小板可能關(guān)系的探索.pdf

1、血管生成素(Angiogenin，ANG)是從人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29的培養(yǎng)基中分離純化的生長(zhǎng)因子，因其具有強(qiáng)有力的促血管新生能力而得名．它是一個(gè)由123個(gè)氨基酸殘基組成的堿性蛋白，分子量約為14 kDa，屬核糖核酸酶超家族，具有促血管生成必不可少的微弱核糖核酸酶活性(約比核糖核酸酶A低5到6個(gè)數(shù)量級(jí))。正常人體循環(huán)血液中存在一定濃度的血管生成素，約為300-400 ng／ml；而在一些血管生成相關(guān)疾病患者的血液中，血管生成素濃度明顯增

2、高，甚至超過500ng/ml．目前，我們不了解血液中為什么需要存在如此高濃度的血管生成素，也不十分了解它在這些血管生成相關(guān)疾病進(jìn)程的作用。 血小板作為血管中流動(dòng)的血液的基本組分之一，在某些刺激因素的作用下可以活化，發(fā)生聚集、粘附和／或釋放反應(yīng)，不僅在止血、凝血和維持血管壁完整性等正常生理功能中起關(guān)鍵作用，而且參與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展．研究發(fā)現(xiàn)，血小板顆粒內(nèi)含有bFGF、VEGF等血管生成調(diào)節(jié)因子，當(dāng)血管損傷時(shí)，活化的血小板將這些

3、調(diào)節(jié)因子釋放到血液中，從而調(diào)節(jié)血管生成．有意思的是，在糖尿病、外周動(dòng)脈閉塞性疾病(peripheral arterial occlusive disease，PAOD)和腫瘤等患者的血液中，血管生成素的濃度與血小板的活性都有所增高．因此，我們認(rèn)為探索了解血小板中是否存在血管生成素以及血小板與血管生成素問的關(guān)系是有重要意義的。 為此，在本論文的第一部分，我們首先運(yùn)用免疫印跡(Western Blot)和細(xì)胞免疫熒光的方法研究了血管

4、生成素在血小板內(nèi)的存在情況。將血液中的血小板分離、洗滌、裂解后，進(jìn)行SDS-PAGE，然后把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，利用抗血管生成素的抗體檢測(cè)到血小板中確實(shí)存在ANG。同時(shí)，本論文還利用間接免疫熒光法研究ANG在血小板中的定位情況。激光共聚焦顯微鏡拍攝的圖片表明，ANG廣泛散布于血小板中，并且和假性血管血友病因子(von Willebrand Factor，vWF，一種存儲(chǔ)于α顆粒中的分子)在位置上有一定程度的重疊，提示ANG可能存在于血小板

5、的α顆粒中．本論文的第二部分主要探索血管生成素與血小板在功能上的關(guān)系。首先，為明確ANG對(duì)血小板釋放功能的影響，我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)膜表面表達(dá)P選擇素(P-selectin)的血小板百分率，以評(píng)價(jià)ANG(500 ng／ml和2500 ng／ml)能否誘導(dǎo)血小板脫顆粒。結(jié)果顯示ANG對(duì)于靜息狀態(tài)(rest)的血小板沒有明顯的促顆粒內(nèi)容物釋放的作用。其次，為探索ANG與其它血小板活化因素對(duì)血小板聚集功能的影響，我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)膜表面

6、結(jié)合纖維蛋白原(fibrinogen binding)的血小板百分率，以評(píng)價(jià)在ADP(10-6M)和凝血酶(Thrombin，0.04 U／ml)的激活作用下，ANG(2500 ng／ml)能否促進(jìn)或抑制血小板聚集。結(jié)果表明，不論ANG與血小板孵育多少時(shí)間，不存在與ADP或Thrombin的協(xié)同或拮抗效應(yīng)。另外，我們還利用血小板聚集儀測(cè)定富血小板血漿(Platelet Rich Plasma，PRP)的透光性，來直觀地研究在ADP(10

7、-6 M)或膠原(collagen，lμg／ml)的作用下，ANG(2500 ng／ml)對(duì)血小板聚集的影響。結(jié)果顯示不論ANG與血小板孵育多少時(shí)間，不存在與協(xié)同或拮抗效應(yīng)。最后，為探討ANG與collagen對(duì)血小板粘附功能的影響，我們應(yīng)用血小板流動(dòng)小室模擬小動(dòng)脈或中動(dòng)脈狹窄時(shí)的血流(剪切力為1500s-1)觀察在collagen(0.2μg／cm2和1μg／cm2)包被的玻片上，ANG(2500ng／ml)能否促進(jìn)或抑制血小板粘附。