魚類感染兩種新型病毒SGIV和SVCV-A1后免疫相關(guān)基因的表達(dá)分析和功能初步研究.pdf

1、1.石斑魚是我國廣東等南方沿海各省的名貴海水養(yǎng)殖魚類。虹彩病毒是近年來全球范圍內(nèi)最嚴(yán)重的魚類傳染性病毒之一，至今已感染包括石斑魚在內(nèi)的100多種養(yǎng)殖魚類，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。由于缺乏養(yǎng)殖石斑魚的遺傳背景和基因組信息，因而對(duì)石斑魚抗病毒和免疫相關(guān)的功能基因了解甚少，尚不清楚石斑魚宿主與虹彩病毒相互作用的分子機(jī)制，。在擁有近海實(shí)驗(yàn)基地養(yǎng)殖系統(tǒng)和病毒基因組數(shù)據(jù)庫基礎(chǔ)上，首次利用抑制性消減雜交(SSH)結(jié)合基因芯片和DNA微陣列技術(shù)，通過研究分析

2、石斑魚與虹彩病毒相互作用的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)并鑒定新的石斑魚抗病毒功能基因。
　　 (1)利用抑制性消減雜交(SSH)結(jié)合基因芯片技術(shù)篩選石斑魚與感染和免疫相關(guān)的功能基因。本研究對(duì)石斑魚在虹彩病毒感染前后的脾組織樣品進(jìn)行抑制削減雜交，成功構(gòu)建了2個(gè)石斑魚感染SGIV的SSH文庫。并對(duì)結(jié)果進(jìn)行克隆測序、拼接和比對(duì)，結(jié)果顯示差異表達(dá)基因數(shù)量共計(jì)413個(gè)，從中發(fā)現(xiàn)和篩選石斑魚與抗病毒和免疫相關(guān)的基因有20多個(gè)：抗菌肽、熱休克A蛋白、TLR

3、、pleurocidin-like peptide Hb26、補(bǔ)體成分C9、補(bǔ)體成分C3、C型凝集素、泛素?cái)y帶蛋白E2-C、免疫球蛋白u(yù)、RNA聚合酶Ⅱ延伸因子、血紅蛋白β鏈、MHC I受體和β胸腺素、TCTP蛋白、MHC、HLA、DPB、細(xì)胞色素b等。
　　 (2)應(yīng)用基因芯片技術(shù)將差異表達(dá)的413個(gè)ESTs制作成DNA微陣列基因芯片，用感染SGIV病毒后不同時(shí)間點(diǎn)的石斑魚肝、脾、腎組織的cDNA和DNA微陣列芯片進(jìn)行雜交，掃

4、描感染樣品的信號(hào)并分析在感染和復(fù)制過程中，病毒對(duì)石斑魚宿主基因的動(dòng)態(tài)調(diào)控，進(jìn)一步確定SSH篩選到的部分基因的差異，并發(fā)現(xiàn)不同時(shí)間水平表達(dá)量的差異。應(yīng)用Real-time RT-PCR對(duì)篩選到的部分石斑魚抗病毒新基因進(jìn)行時(shí)態(tài)鑒定和功能驗(yàn)證分析。此外，選擇部分基因進(jìn)行克隆表達(dá)、以及魚類細(xì)胞培養(yǎng)病毒感染抑制系統(tǒng)分析和其免疫和抗病功能方面的初步研究。
　　 此研究在病毒和宿主兩個(gè)層次上，通過揭示病毒感染致病以及宿主防御的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與

5、感染有關(guān)的免疫和抗病毒新功能基因，對(duì)于這些基因與相關(guān)的信號(hào)通路、及其在機(jī)體中的作用通路的研究將有助于了解病毒感染的病理變化機(jī)制。鑒定本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的石斑魚抗病毒和免疫相關(guān)的新功能基因，為有效的抗病毒新對(duì)策提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。。
　　 2.Spring viraemia of carp virus(SVCV)作為一種重大魚類病原，最初發(fā)現(xiàn)于歐洲鯉魚養(yǎng)殖業(yè)，可導(dǎo)致鯉魚的相互感染和交叉感染。SVCV-A1病毒株來源于中國大陸已被成功分

6、離，并且本實(shí)驗(yàn)室已成功建立了SVCV-A1感染斑馬魚(Danio rerio)的感染模型。斑馬魚(Danio rerio)已經(jīng)成為一種用于研究脊椎動(dòng)物發(fā)育學(xué)遺傳學(xué)的模型生物，目前，隨著斑馬魚全基因組序列的成功建立和深入研究，斑馬魚已經(jīng)進(jìn)一步作為模型用于人類疾病，癌癥和免疫學(xué)的研究。斑馬魚作為感染模型已經(jīng)得到了長足關(guān)注和不斷進(jìn)步。
　　 為了研究病毒感染過程中肝臟的發(fā)病機(jī)理，捕獲肝臟炎癥反應(yīng)的分子水平信號(hào)和轉(zhuǎn)錄表達(dá)狀況，深入探究病

7、毒感染引起的分子免疫機(jī)理。SVCV-A1用來感染斑馬魚成魚，在24hr,48hr和96hr獲取其肝臟組織。進(jìn)行斑馬魚全基因組芯片的表達(dá).和組織顯微病變和相關(guān)功能蛋白的免疫共沉淀觀察。觀察結(jié)果表明：SVCV-A1感染24小時(shí)的斑馬魚肝臟細(xì)胞并無明顯的組織損傷，感染48小時(shí)的肝臟組織觀察到一定的損害，感染96小時(shí)時(shí)斑馬魚肝臟組織嚴(yán)重?fù)p傷且細(xì)胞形態(tài)腫大、形狀畸變、數(shù)量減少甚至出現(xiàn)了空泡。通過對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的定量分析表明在感染96小時(shí)其形態(tài)變化的

8、差異極顯著。免疫組化沉淀結(jié)果顯示SVCV的感染造成E-Cadherin的表達(dá)或者功能損失，細(xì)胞胞間連接變形；高表達(dá)量的cytokeratin說明感染造成的化膿和組織嚴(yán)重變態(tài)。凋亡原位檢測(Apop-Tag)染色結(jié)果顯示，SVCV感染24小時(shí)的斑馬魚肝臟組織已經(jīng)發(fā)生細(xì)胞凋亡，96hr時(shí)肝臟組織細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡。Periodic acid-Schiff(PAS)染色顯示，病毒的感染過程伴隨有肝臟細(xì)胞中肝糖內(nèi)容物明顯減少和肝糖原代謝的紊

9、亂。此研究結(jié)果顯示病毒感染過程中，伴隨有不斷和加劇的細(xì)胞凋亡發(fā)生，細(xì)胞之間的相互作用也因?yàn)檎辰拥鞍椎钠茐脑馐芷茐?、上皮?xì)胞骨架的形態(tài)也不斷的惡化，同時(shí)造成嚴(yán)重失調(diào)或者紊亂的肝糖量代謝(glycogen，glycoprotein，proteoglycans)。
　　 斑馬魚全基因組芯片實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：在病毒感染24hr、48hr和96hr的肝臟組織中，920，348和507個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)具有極其明顯的差異表達(dá)(p-Value＜0.005

10、)。其中有28個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)持續(xù)性的極顯著性差異表達(dá)，推測這些基因可能是病毒感染的引起病變的biomarker基因。部分基因的表達(dá)量通過Realtime-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片的結(jié)果極其一致。利用在線WebGestalk分析和通過GSEA比較全部基因芯片的所有基因的表達(dá)量結(jié)果一致顯示：差異表達(dá)基因的功能主要錨定在重要的信號(hào)通路和作用機(jī)制中：其中最為有意義的有氨基酸、嘌呤代謝途徑、脂肪酸代謝途徑、MAPK、PPAR、TLR、和細(xì)胞凋亡信號(hào)通路

11、、慢性骨髓白血病、胰腺癌疾病等。
　　 SVCV感染的斑馬魚肝臟病變信息和兩種細(xì)菌沙門氏菌(Salmonella typhimurium)和分支桿菌(Mycobacterium marinum)感染斑馬魚的基因組芯片信息結(jié)果比較結(jié)果表明了細(xì)菌性感染和病毒性病變過程中，部分基因在轉(zhuǎn)錄水平具有一致性，但也有特異性。SVCV感染的斑馬魚肝臟病變信息與水泡性口炎病毒(VSV)感染的人星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)控機(jī)制、TGF-KO小鼠肝臟調(diào)控機(jī)制和致

12、癌物誘導(dǎo)的斑馬魚肝臟腫瘤途徑具有最近的一致性。其中有關(guān)細(xì)胞凋亡、組織缺氧和蛋白降解相關(guān)的調(diào)控基因變化高度相似。
　　 通過WebGestalk和GSEA軟件分析的結(jié)果比較一致，篩選到大量的具有研究價(jià)值的信號(hào)通路和代謝機(jī)制的相關(guān)信息，通過組織顯微病變觀察和部分功能蛋白的免疫組織化學(xué)染色方法檢測充分證實(shí)其變化。本研究所得信息將為更深入研究宿主防御機(jī)制和與病毒感染的復(fù)雜機(jī)制提供有力方向和途徑，更為斑馬魚作為一種有效地模式生物用來研究病