牛支原體PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用.pdf

1、牛支原體（Mycoplasma bovis）主要引起牛的肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜炎、結(jié)膜炎等。還可引起一系列的生殖系統(tǒng)疾病?；贾гw肺炎的犢牛死亡率較高，而經(jīng)治療后癥狀緩解的牛一般發(fā)育遲緩，甚至成為廢牛，并嚴重影響牛奶的產(chǎn)量和質(zhì)量。給奶牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。
　　 2007年，山東部分地區(qū)奶牛陸續(xù)出現(xiàn)以發(fā)燒、呼吸困難為主要特征的病例。該病病程近2個月，共有30頭牛不同程度地表現(xiàn)以上臨床癥狀，其中成年牛20頭，發(fā)病率39.2％

2、；育成牛4頭，發(fā)病率57.1％；犢牛6頭，發(fā)病率75％。共死亡1頭，死亡率1.5％，淘汰率3頭，淘汰率4.5％。結(jié)合表現(xiàn)的臨床癥狀及病理剖檢和治療情況，懷疑為支原體感染所致。
　　 采集病牛的肺臟、肝、胸腔滲出物等，接種支原體肉湯培養(yǎng)基，同時剪碎病料呈小塊狀或直接接取胸腔滲出液，在20％馬血清瓊脂培養(yǎng)基上劃線接種，置5％CO2、37℃溫箱中培養(yǎng)，5～7d觀察判定。肉湯培養(yǎng)基中生長初期呈輕微渾濁或呈白色點狀、絲狀生長，以后逐漸均勻

3、渾濁，半透明稍帶乳光，不產(chǎn)生菌膜或沉淀，也無顆粒懸浮。在20％馬血清瓊脂培養(yǎng)基上生長遲緩，為極小的水滴狀圓形略帶灰色的微細菌落，中央有乳頭狀突起。姬姆薩染色，顯微鏡觀察，菌落為多形態(tài)，以球點狀最常見，大小在125～250 nm。
　　 對病牛肺部實變組織進行DNA模板的提取，并分別以牛支原體、無乳支原體、絲狀支原體等為陽性對照，利用支原體通用引物擴增其16SrRNA，建立了擴增16S rRNA序列進行支原體檢測的方法，擴增到16

4、SrRNA的基因片段，大小為1.5kb左右，經(jīng)過測序，并與GenBank公布的支原體16S rRNA基因序列進行比較，分別與幾種支原體陽性樣本的序列同源性均在97～100％。
　　 支原體的培養(yǎng)困難，生長周期長，營養(yǎng)條件苛刻，使其不能作為早期、快速的檢測方法。PCR技術(shù)為DNA體外擴增技術(shù)，呈2n放大效應(yīng)，可檢測樣品中微量級的DNA，具有高靈敏性，因此適于早期檢測。本研究對導(dǎo)致牛支原體病的絲狀支原體絲狀亞種、牛支原體、無乳支原體