牛支原體滅活疫苗的研究.pdf

1、牛支原體(Mycoplasma bovis，M.bovis)是一種引起以牛呼吸系統(tǒng)病為主的重要病原微生物，給國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，國(guó)內(nèi)外對(duì)牛支原體疫苗的研究還不夠成熟，本文在病原分離鑒定以及純化的基礎(chǔ)上建立了M.bovis家兔感染模型，優(yōu)化了M.bovis的滅活條件，成功制備出了M.bovis滅活疫苗，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析了不同免疫劑量和不同免疫途徑對(duì)免疫效果的影響，對(duì)不同佐劑進(jìn)行對(duì)比，找到合適的免疫佐劑，驗(yàn)證免疫效果。具體研究方

2、法如下：
　　1.將不同濃度梯度的M.bovis分離株以滴鼻的方式感染到家兔呼吸系統(tǒng)，通過(guò)比較感染前后家兔的臨床、剖檢各組織病理變化等以判斷是否成功感染，從感染后家兔肺臟、血液中分離出支原體，將培養(yǎng)物純化后進(jìn)行PCR檢測(cè)，進(jìn)一步親緣關(guān)系分析和血清抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示:1.0×108ccu/ml的M.bovis就可使家兔致病，1.0×1010ccu/ml的M.bovis感染到家兔呼吸道之后家兔表現(xiàn)出精神抑郁;剖檢后病變主要表現(xiàn)在肺臟，

3、出現(xiàn)水腫、大理石病變等，部分還出現(xiàn)胸腔積液;從肺臟病變組織切片可見(jiàn)肺泡腔出血，肺泡間隙增寬、細(xì)支氣管上皮黏膜壞死和脫落;用特異性PCR和基因測(cè)序的方法對(duì)感染后家兔體內(nèi)分離到的病原進(jìn)行鑒定，同時(shí)檢測(cè)感染家兔血清中是否出現(xiàn)M.bovis抗體，最終證實(shí)M.bovis在家兔體內(nèi)感染成功。
　　2.用終濃度為0.3％、0.4％、0.5％的甲醛分別對(duì)M.bovis培養(yǎng)物進(jìn)行滅活。為驗(yàn)證滅活效果，將滅活的M.bovis培養(yǎng)物培養(yǎng)并將培養(yǎng)物人工感

4、染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，比較M.bovis培養(yǎng)物免疫前后的免疫原性。結(jié)果顯示:終濃度為0.5％的甲醛短期內(nèi)就能將M.bovis徹底滅活，但其免疫原性大大降低，不利于滅活疫苗的制備，終濃度為0.3％的甲醛處理60h后只能將M.bovis部分滅活，終濃度為0.4％的甲醛滅活48h后能將支原體徹底滅活，免疫原性略微降低不影響免疫效果，為最佳滅活條件。
　　3.先將M.bo協(xié)液體培養(yǎng)物用終濃度為0.4％的甲醛滅活，其次以用0.1mol/L的PBS洗滌

5、后分別與白油、氫氧化鋁、弗氏完全佐劑混合得到5.0×109ccu/ml的M.bovis滅活疫苗，將洗滌后的培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋后得到1.0×101occu/ml的滅活疫苗，對(duì)疫苗穩(wěn)定性和無(wú)菌性進(jìn)行檢測(cè)，最終證實(shí)疫苗安全可靠，可以使用。
　　4.將自制的M.bovis滅活疫苗以不同劑量，不同的免疫途徑，添加不同佐劑對(duì)家兔進(jìn)行免疫。免疫后通過(guò)觀察家兔臨床表現(xiàn)和注射部位的變化來(lái)評(píng)價(jià)疫苗的安全性，通過(guò)監(jiān)測(cè)家兔體內(nèi)免疫球蛋白(IgG、IgM

6、)、細(xì)胞因子IL-4和干擾素IFN-γ、血清抗體水平的變化來(lái)篩選最佳的免疫劑量、途徑以及合適的佐劑。結(jié)果顯示:2ml1.0×1010ccu/ml的滅活苗具有很好的保護(hù)效果;肌注后免疫效果最佳;將白油佐劑與滅活的M.bo惦培養(yǎng)物1∶1混合后免疫效果較氫氧化鋁和弗氏完全佐劑強(qiáng)。
　　5.為了驗(yàn)證自制M.bovis滅活疫苗的免疫效果。用M.bovis滅活疫苗對(duì)家兔免疫后用不同來(lái)源的M.bovis培養(yǎng)物進(jìn)行攻毒，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)家兔進(jìn)行病理分析