豬肺炎支原體原位雜交檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、豬肺炎支原體（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）引起的豬支原體肺炎（MycoplasmapneumoniaeofSwine，MPS）或稱豬喘氣病是一種接觸性慢性呼吸道傳染病，主要癥狀為久咳、生長(zhǎng)遲緩，死亡率較低但發(fā)病率很高。Mhp是通過(guò)與豬呼吸道纖毛上皮細(xì)胞的緊密結(jié)合，而不是通過(guò)組織侵入機(jī)體的。它通過(guò)黏附感染豬支氣管纖毛上皮細(xì)胞，使纖毛發(fā)生萎縮或脫落，繼而產(chǎn)生后續(xù)的致病作用。目前實(shí)驗(yàn)室常用檢測(cè)方法為PCR檢測(cè)抗原和

2、ELISA檢測(cè)抗體，只能確定是否感染Mhp，不能對(duì)其進(jìn)行定位。原位雜交技術(shù)（insituhybridzationhistochemistry，ISHH）作為目前最為有效的分子病理學(xué)、分子遺傳學(xué)技術(shù)之一，其最大的優(yōu)點(diǎn)是：能在細(xì)胞或組織中明確檢出特異DNA或RNA，并顯示其狀態(tài)及形態(tài)特征。
　　 本試驗(yàn)根據(jù)GenBank中登錄的豬肺炎支原體P36基因序列，設(shè)計(jì)與合成了一條25bp地高辛標(biāo)記的DNA寡核苷酸探針。采用實(shí)驗(yàn)室已建立的斑點(diǎn)

3、雜交法對(duì)探針特異性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對(duì)Mhp168株、J株、濟(jì)南株、232株都有陽(yáng)性反應(yīng)，不能與雞毒支原體反應(yīng)，表明P36探針有較強(qiáng)的特異性。
　　 用地高辛標(biāo)記的P36寡核苷酸探針，對(duì)豬呼吸道組織切片進(jìn)行原位雜交，選定陰陽(yáng)性組織，對(duì)原位雜交各項(xiàng)條件優(yōu)化，確定胃蛋白酶消化20min、探針濃度1μg/mL、顯色時(shí)間3h，初步建立了豬肺炎支原體原位雜交檢測(cè)法。
　　 使用建立的原位雜交檢測(cè)方法分別對(duì)經(jīng)豬支原體肺炎活疫苗氣霧免疫后不同