實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測豬肺炎支原體研究.pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是豬支原體肺炎的主要病原體，也是豬呼吸道病綜合征(Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC)的主要原發(fā)性病原之一。其主要危害是引起豬的生長受阻和飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。 Mhp培養(yǎng)物的定量檢測方法主要有顏色變化單位(color change unit，CCU)檢測、菌落形成單位(colonyfor

2、mingunit，CFU)檢測、濃縮培養(yǎng)物的濁度測定等。鑒于上述方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，實(shí)驗(yàn)過程中容易污染，常引起鑒定、計(jì)數(shù)誤差，本研究建立了可以對Mhp培養(yǎng)物定量的熒光定量PCR(Fluorescent Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)檢測方法，并與傳統(tǒng)的Mhp定量檢測方法進(jìn)行了比較，為Mhp生長特性、培養(yǎng)物定量等相關(guān)領(lǐng)域研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究的主要內(nèi)容及結(jié)果如下： 1、FQ-PCR檢測方法的建立：根據(jù)GenBank

3、公布的Mhp保守區(qū)域p110基因序列，設(shè)計(jì)一對特異引物和TaqMam探針，同時(shí)構(gòu)建含有p110基因部分序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pEASY-T1-p110，定量后作為模板，對FQ-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了可以對Mhp培養(yǎng)物定量的的FQ-PCR檢測方法。研究結(jié)果表明，該方法檢測靈敏度可達(dá)13copy/μL，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式為：Ct=-3.320×1g(copy/μL)+32.545：與常見的其他支原體、病毒和細(xì)菌無交

4、叉反應(yīng)；對起始濃度為1.3×105、1.3×104、1.3×103copy/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的實(shí)際檢測值分別為1.332×105、1.293×104和1.260×103copy/μL，對標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒實(shí)際檢測值與理論值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)假設(shè)測驗(yàn)u測驗(yàn)，p的數(shù)值分別為0.5322、0.8634和0.4872(p>0.05)，兩者差異不顯著。證明該方法具有較高的靈敏度、良好的特異性和準(zhǔn)確性。 2、三種定量方法的比較：應(yīng)用CCU檢測法、濁度法和FQ-P

5、CR法研究Mhp的生長曲線，并進(jìn)行簡單相關(guān)回歸分析。結(jié)果表明，在Mhp的培養(yǎng)過程中，F(xiàn)Q-PCR與濁度法檢測結(jié)果一直呈高度相關(guān)，其回歸方程為OD=0.922398×lgcopy-6.578453：在培養(yǎng)54小時(shí)內(nèi)，F(xiàn)Q-PCR與CCU法的檢測結(jié)果呈高度相關(guān)，其回歸方程為lgCCU=2.501728×lgcopy-13.693792。對回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，lgCCU/mL的理論值與實(shí)測值差異不顯著(p=0.2958>0.05)，OD420的