綿羊肺炎支原體PCR快速檢測(cè)方法的建立及其P40蛋白的抗原性研究.pdf

1、綿羊肺炎支原體是綿羊最為常見的一種呼吸道疾病，由于它的死亡率比較低，一直以來(lái)并沒(méi)有引起人們的重視，但從近年來(lái)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該病的死亡率呈上升趨勢(shì)，尤其是羔羊，在世界上許多國(guó)家地區(qū)普遍流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成巨大威脅。除此以外國(guó)內(nèi)外對(duì)綿羊肺炎支原體的致病機(jī)理、分子生物學(xué)等方面的研究進(jìn)展還很緩慢。因此本試驗(yàn)應(yīng)用綿羊肺炎支原體Y98標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行了P40蛋白的抗原性研究，并建立了早期快速PCR診斷綿羊肺炎支原體的方法，為臨床上防

2、治該病提供了有參考價(jià)值的數(shù)據(jù)。 綿羊肺炎支原體為無(wú)細(xì)胞壁微生物，人工培養(yǎng)較困難，加之分離培養(yǎng)方法繁瑣耗時(shí)，特別是對(duì)于難培養(yǎng)的支原體:血清學(xué)診斷方法是支原體感染通常使用的方法，然而種間的交叉反應(yīng)，非特異性反應(yīng)的存在，極大阻礙了血清學(xué)方法的應(yīng)用。此外，鑒定支原體分離株需要對(duì)應(yīng)的特異的高免血清，而這些血清是不易得到的。PCR的方法克服了這些缺點(diǎn)，它己經(jīng)成為一種非常有效的檢測(cè)微生物的方法。本次試驗(yàn)根據(jù)綿羊肺炎支原體的標(biāo)準(zhǔn)株Y98的16S

3、rRNA基因兩端的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于PCR法快速診斷，同時(shí)用肺炎支原體絲狀支原體絲狀亞種LC型Y-goat、金黃色葡萄球菌ATCC6538、大腸桿菌C83901作對(duì)照，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)株Y98綿羊肺炎支原體分離株HD-1、HD-2均可以擴(kuò)增出與預(yù)期結(jié)果相符的197bp的片斷，可以明顯區(qū)分出這幾種病原體，具有很好的的特異性，該方法可以檢1pg的綿羊肺炎支原體DNA，具有高度的敏感性，本試驗(yàn)擴(kuò)增出本實(shí)驗(yàn)室保留的綿羊肺炎支原體分離株HD1、H

4、D2，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。 本試驗(yàn)以綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98和絲狀支原體絲狀亞種標(biāo)準(zhǔn)株Y-goat為試驗(yàn)材料，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)免疫印跡試驗(yàn)對(duì)綿羊肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株Y98的抗原性進(jìn)行了初步探索，并回收P40蛋白進(jìn)行抗原性研究。SDS-PAGE結(jié)果顯示:綿羊肺炎支原體Y98株全蛋白的分子量范圍為14KD-105KD，得到了16條蛋白帶，其中主要有8種蛋白，其分子量分別為105KD，96KD，6