實(shí)驗(yàn)動物金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體多重PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、目的：實(shí)驗(yàn)動物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和條件，實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量直接影響眾多領(lǐng)域科學(xué)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，也關(guān)系到實(shí)驗(yàn)動物從業(yè)人員和動物實(shí)驗(yàn)操作者的健康。因此，實(shí)驗(yàn)動物的微生物質(zhì)量控制已納入國家標(biāo)準(zhǔn)。肺支原體(Mycoplasma pulmonis)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是實(shí)驗(yàn)動物微生物檢測需要排除的病原體，也是實(shí)驗(yàn)動物常見的易感病原體，在大小鼠、豚鼠、地

2、鼠和兔中感染率可達(dá)到百分之幾，甚至百分之幾十，相對其它病原體感染率較高。
　　目前對實(shí)驗(yàn)動物攜帶的金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體的鑒定主要以分離純化培養(yǎng)、生化試驗(yàn)等方法進(jìn)行，存在費(fèi)時費(fèi)力、需要有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員以客觀指標(biāo)加主觀判斷鑒定的缺點(diǎn)，如金黃色葡萄球菌從分離細(xì)菌到發(fā)出檢測報告往往需要48h，綠膿桿菌需要長達(dá)72h，而肺支原體培養(yǎng)完成檢測則需21天。而PCR(Polymerase Chain Reaction)技術(shù)以其簡便、

3、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)已在臨床醫(yī)學(xué)疾病診斷等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，理論上同樣也可應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動物的病原微生物檢測，但普通 PCR方法單管每次只能檢測一種病原體，不能滿足單管檢測多種病原體的實(shí)際需要，更滿足不了大樣本、快速、準(zhǔn)確的檢測。
　　多重PCR（multiplex PCR）可以在同一管反應(yīng)體系中擴(kuò)增出大小不同的核酸片段，具有快捷方便、高通量等優(yōu)點(diǎn)。多重PCR如果應(yīng)用在實(shí)驗(yàn)動物微生物檢測中，可以同時檢測多種病原體，適合大量實(shí)驗(yàn)動物微生物檢

4、測與鑒定，具有高靈敏性、高效性、高特異性和低成本性等優(yōu)點(diǎn)。
　　本研究目的是針對三種實(shí)驗(yàn)動物病原體金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體，建立多重PCR檢測方法，并與傳統(tǒng)的微生物檢測方法比較，檢驗(yàn)多重PCR檢測方法的可操作性和準(zhǔn)確性。
　　方法：
　　1、將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株轉(zhuǎn)接到SP瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接到血液瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行分離與純化培養(yǎng)，顯微鏡鏡下觀察，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)和甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)；將綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)株轉(zhuǎn)接

5、到NAC液體培養(yǎng)基，后轉(zhuǎn)接到NAC固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離與純化培養(yǎng)，顯微鏡鏡下觀察，生化鑒定，氧化酶試驗(yàn)，42℃生長試驗(yàn)；將肺支原體接到液體培養(yǎng)基中，一周后進(jìn)行觀察。
　　2、通過文獻(xiàn)查找肺支原體、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌特異性引物，使用Blast分析各病原體引物特異性；進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，通過生物信息學(xué)分析驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物正確性；
　　3、優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，檢測PCR方法的特異性和敏感性。將模板DNA按照10倍

6、的比例進(jìn)行梯度稀釋，分別以稀釋后的模板DNA進(jìn)行擴(kuò)增；用接種針挑取菌落加入到裝有普通營養(yǎng)肉湯的試管中，放入37℃恒溫?fù)u床中進(jìn)行擴(kuò)菌，將搖好的菌液按著10倍比例進(jìn)行梯度稀釋，轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，提取菌液核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增其他非目的菌進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。
　　4、將肺支原體、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的基因組 DNA在同一反應(yīng)體系同時擴(kuò)增，并且在反應(yīng)體系中加入細(xì)菌通用引物做為內(nèi)質(zhì)控，調(diào)整和優(yōu)化反應(yīng)體系成分和反應(yīng)條件，建立三種

7、病原體多重PCR檢測方法。選擇具有實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)資質(zhì)的單位供應(yīng)的動物：大小鼠共45只，采集實(shí)驗(yàn)動物回盲部內(nèi)容物或糞便以及動物氣管分泌物，提取核酸進(jìn)行三種病原體多重PCR的檢測，同時進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法，將兩種檢測結(jié)果比較，檢驗(yàn)多重PCR檢測方法的可操作性和準(zhǔn)確性。
　　結(jié)果：
　　1、金黃色葡萄球菌在SP固體培養(yǎng)基上形成黃色的菌落，轉(zhuǎn)接血瓊脂平皿形成灰白色、周圍有β溶血環(huán)的菌落；菌體形態(tài)為革蘭陽性球菌，排列成葡萄狀；甘露醇發(fā)酵

8、試驗(yàn)為陽性；血漿凝固酶試驗(yàn)為陽性。綠膿桿菌在NAC瓊脂平皿上形成扁平菌落，邊緣不齊呈鋸齒狀，大部分菌落可產(chǎn)生綠色色素而致使培養(yǎng)基呈綠色；菌體特征為革蘭陰性桿菌，菌體長短不一；各生化鑒定管陰陽性結(jié)果正確；氧化酶試驗(yàn)和42℃生長試驗(yàn)為陽性。肺支原體液體培養(yǎng)顏色由紅色變?yōu)辄S色。
　　2、獲得三種病原體的特異性引物，并通過Blast比對驗(yàn)證引物的特異性，金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為153bp、375bp和266bp

9、，其測序結(jié)果分別與Genebank對應(yīng)序列（Sequence ID分別為: gb|DQ507378.1、dbj|AB926025.1、gb|KP836312.1）相似度分別為97.00％、98.90%和99.59%。
　　3、PCR特異性實(shí)驗(yàn)：金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌和肺支原體特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增出陽性條帶外，其它菌種均擴(kuò)增陰性；敏感性實(shí)驗(yàn)：金黃色葡萄球菌PCR擴(kuò)增最小檢出DNA核酸量為1pg、最小檢出菌落數(shù)為2CFU；

10、綠膿桿菌PCR擴(kuò)增最小檢出DNA核酸量為10pg，最小檢出菌落數(shù)為14CFU；肺支原體PCR擴(kuò)增最小檢出DNA核酸量為1pg。
　　4、建立了金黃色葡萄球菌、肺支原體、綠膿桿菌和細(xì)菌通用基因的多重PCR擴(kuò)增體系，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳出四個條帶，片段大小從小到大分別為153bp、266bp、375bp和520bp。PCR檢測實(shí)驗(yàn)動物24h培養(yǎng)物中的菌落，其結(jié)果與實(shí)驗(yàn)動物微生物檢測結(jié)果一致；檢測實(shí)驗(yàn)動物糞便，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法相