原料乳中金黃色葡萄球菌的分離及PCR檢測.pdf

1、食源性疾病是近年來倍受關(guān)注的話題之一，對相關(guān)的食源性致病菌的檢測研究受到了前所未有的重視，其中細(xì)菌性食物中毒又占據(jù)了重要地位。金黃色葡萄球菌(金葡菌)是引起食物中毒的主要病源菌之一，同時(shí)也是引起奶牛乳房炎及多種臨床化膿性感染的主要病原菌，其快速檢測技術(shù)一直是研究熱點(diǎn)。PCR技術(shù)自問世以來由于其本身高特異性、靈敏性及操作簡便等常規(guī)方法無法媲美的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于包括食品微生物檢測在內(nèi)的諸多領(lǐng)域。 本實(shí)驗(yàn)首先利用金葡菌的高度耐鹽性及

2、法國梅里埃公司的選擇性培養(yǎng)基(Baird-Parker+兔血漿)自行從乳中分離出金葡菌菌株；對陽性標(biāo)準(zhǔn)株ATCC25923、自行分離金葡菌株，以及大腸桿菌、沙門氏菌等陰性對照菌同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以是否出現(xiàn)279bp條帶為標(biāo)準(zhǔn)驗(yàn)證nuc基因?qū)鹌暇奶禺愋?，完成了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序并與Genebank中標(biāo)準(zhǔn)序列V01281比對，結(jié)果顯示兩者有99％的同源性，進(jìn)一步確定了擴(kuò)增片段的特異性；通過比較75％乙醇、丙酮預(yù)處理后的擴(kuò)增效果確定了

3、丙酮處理對金葡菌細(xì)胞壁有更好的裂解作用；以影響PCR反應(yīng)的主要因素：Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度及Taq酶濃度為對象進(jìn)行了單因素及多因素正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，并最終確定了各成分的最佳配比為：Mg2+2ul、引物2ul、dNTP3ul、Taq酶1.5U。在上述實(shí)驗(yàn)條件下確定了檢測靈敏性為1.2×105cfu/ml菌或19.95ngDNA；干擾實(shí)驗(yàn)表明大腸桿菌和沙門氏菌對特異性擴(kuò)增及靈敏性無明顯影響；培養(yǎng)基增菌檢測實(shí)驗(yàn)表明：初始菌濃度為1.

4、5×104、103、102cfu/ml時(shí)PCR方法可分別在培養(yǎng)4h、6h及12h后檢出。 比較了生理鹽水洗滌、PBS緩沖液洗滌和有機(jī)試劑處理三種方法對乳中金葡菌DNA提取的不同影響作用，確定了有機(jī)試劑處理對排除乳中背景基質(zhì)的影響作用效果最好；靈敏性實(shí)驗(yàn)表明可檢測出乳中存在的3.2×105cfu/ml金葡菌，或25.4ngDNA，這與培養(yǎng)基中的檢測靈敏性接近；初步比較了不同乳脂含量、乳鈣含量對PCR反應(yīng)的影響作用，發(fā)現(xiàn)乳脂含量對擴(kuò)

5、增結(jié)果無明顯影響，而乳鈣含量則相對來說有更明顯的影響作用； 對典型的市售食品(羊肉片、豆腐干、肉腸、巴氏乳)進(jìn)行了增菌檢測實(shí)驗(yàn)，雖然由于各次實(shí)驗(yàn)中初始接菌量及增菌條件略有不同而導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)了一定的差異，但從整體來看，初始菌量為10、102、103cfu/ml時(shí)各種食品中均可以在10h內(nèi)檢測出。 本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了nuc基因在金黃色葡萄球菌鑒定實(shí)驗(yàn)中的特異性，通過優(yōu)化反應(yīng)條件確定了PCR檢測的靈敏性，并完成了幾中常見市售食品