轉(zhuǎn)基因克隆法制作人溶酶體β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反應(yīng)器的研究.pdf

1、人溶酶體β-葡萄糖苷酶(human lysosomal acidβ-glucosidase,GlcCerase)是糖蛋白降解途徑的主要外糖苷酶,參與糖蛋白的回收利用。該酶減少或缺失會(huì)導(dǎo)致葡萄糖腦苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉積,從而使機(jī)體發(fā)生廣泛的病理變化,臨床上稱為“戈謝病”,酶替代法是目前該病的主要療法。人體來(lái)源的GlcCerase獲得極為困難,應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組人GlcCerase雖然已經(jīng)有一些成功的

2、報(bào)道,但也面臨許多難以克服的問題,如在CHO細(xì)胞表達(dá)重組人GlcCerase,生產(chǎn)成本過于昂貴；在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá),存在重組蛋白質(zhì)中糖鏈結(jié)構(gòu)的改變以及下游加工處理困難等限制。如果應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)重組人GlcCerase,在得到天然活性較高產(chǎn)品的同時(shí),將極大地降低生產(chǎn)成本,具有其它表達(dá)系統(tǒng)所不能代替的優(yōu)勢(shì)。然而,顯微注射法的高成本、低效率長(zhǎng)期以來(lái)制約著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究的發(fā)展,體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因與核移植相結(jié)合制備動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器是

3、當(dāng)今轉(zhuǎn)基因整合表達(dá)的一種有效途徑。因此,本研究選取人溶酶體β-葡萄糖苷酶作為研究對(duì)象,首先克隆人GlcCerasecDNA序列并對(duì)其在COS7細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行初步研究,然后構(gòu)建含有人GlcCerasecDNA的乳腺表達(dá)載體,經(jīng)體外培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞驗(yàn)證載體的有效性后,進(jìn)一步將該載體轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞,篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆株,通過體細(xì)胞核移植法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因奶山羊克隆胚胎,以期獲得乳腺特異性表達(dá)GlcCerase的轉(zhuǎn)基因奶山羊乳腺生物

4、反應(yīng)器。
　　 本研究共分為六個(gè)部分,第一、二部分進(jìn)行了人GlcCerase基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建及體外細(xì)胞表達(dá)研究；第三、四部分主要是分離培養(yǎng)了奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞,并優(yōu)化了脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染該細(xì)胞的體系,獲得了穩(wěn)定整合人GlcCerase基因的供體細(xì)胞；第五部分利用轉(zhuǎn)人GlcCerase基因的奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行了核移植,研究轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞對(duì)克隆胚胎體外發(fā)育的支持作用,并對(duì)克隆胚胎進(jìn)行了胚胎移植；第六部分探討了外源基因?qū)?/p>

5、對(duì)奶山羊體細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)水平的影響。主要的研究結(jié)果如下:
　　 第一部分:人GlcCerase cDNA序列的克隆及真核細(xì)胞表達(dá)試驗(yàn)中,首先從人胎盤組織中分離提取得到總RNA,利用RT-PCR方法,直接獲得人GlcCerase基因的編碼序列,經(jīng)測(cè)序分析,所得GlcCerase cDNA與GeneBank中同源性為99％,發(fā)現(xiàn)1個(gè)堿基差異,導(dǎo)致天冬氨酸到甘氨酸的改變。為了盡快檢測(cè)所獲得的目標(biāo)基因是否能正常編碼獲得

6、重組蛋白質(zhì),本試驗(yàn)以pEGFP-C1為基礎(chǔ)質(zhì)粒,構(gòu)建了含有人GlcCerase基因的真核表達(dá)載體pEGFP-GlcCerase。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將該載體轉(zhuǎn)染入COS7細(xì)胞中進(jìn)行暫態(tài)表達(dá)研究,可見報(bào)告基因GFP順利表達(dá),經(jīng)RT-PCR和熒光酶學(xué)法進(jìn)行驗(yàn)證,在細(xì)胞中檢測(cè)到了GlcCerase的mRNA表達(dá),并在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中檢測(cè)到了GlcCerase的生物活性。這些結(jié)果表明所克隆的人GlcCerase cDNA能夠正確編碼蛋白,發(fā)揮生物學(xué)功能

7、,可以用于下一步的乳腺表達(dá)載體構(gòu)建。
　　 第二部分:人GlcCerase基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及乳腺細(xì)胞表達(dá)試驗(yàn)中,將在體外經(jīng)真核細(xì)胞表達(dá)驗(yàn)證正確的GlcCerase基因以及細(xì)胞篩選標(biāo)記基因(Neor)插入含有山羊β-酪蛋白基因調(diào)控序列的pBCl載體中,經(jīng)PCR、酶切和測(cè)序鑒定,得到正確的重組質(zhì)粒pBC1-GlcCerase-Neo.為了檢測(cè)乳腺表達(dá)載體的有效性,將該載體轉(zhuǎn)染入小鼠乳腺上皮細(xì)胞系-HC-11細(xì)胞中,經(jīng)G4

8、18抗性篩選,獲得陽(yáng)性克隆細(xì)胞,將克隆細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)后,經(jīng)PCR檢測(cè)結(jié)果表明,人GlcCerase基因己成功轉(zhuǎn)入到HC-11細(xì)胞中。進(jìn)一步用催乳素、胰島素及氫化可的松誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,經(jīng)RT-PCR和Western—blot檢測(cè)表明,山羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的人GlcCerase基因能夠在乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄翻譯并分泌到胞外。這些結(jié)果表明,所構(gòu)建的人GlcCerase基因乳腺表達(dá)載體具有生物學(xué)功能,為下一步利用該載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞

9、的建立奠定了基礎(chǔ)。
　　 第三部分:奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染研究,采用組織塊培養(yǎng)法結(jié)合胰蛋白酶消化法分離純化得到奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞,繪制了生長(zhǎng)曲線,鑒定了胎兒細(xì)胞性別及核型特征,結(jié)果表明:該培養(yǎng)體系可以支持奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的體外生長(zhǎng),其細(xì)胞形態(tài)為梭形,高度匯合后呈火焰狀,增殖特性以及核型特征均為正常,性別鑒定顯示該奶山羊胎兒細(xì)胞為雌性,符合體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因克隆的基本要求。進(jìn)一步利用脂質(zhì)體法將pEGFP-C1

10、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入該細(xì)胞,研究了脂質(zhì)體量、質(zhì)粒量和轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響,獲得了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染該細(xì)胞的最佳條件:24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中采用4.0μL脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑,1.2μg質(zhì)粒DNA,細(xì)胞在復(fù)合物中孵育6 h。這為下一步目的基因轉(zhuǎn)染奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的研究提供了參考依據(jù)。
　　 第四部分:建立轉(zhuǎn)人GlcCerase基因奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞的試驗(yàn),利用上述優(yōu)化的轉(zhuǎn)染體系,將線性化的乳腺特異性表達(dá)載體pBC1-GlcCerase-Neo轉(zhuǎn)染胎

11、兒成纖維細(xì)胞,經(jīng)G418篩選8～10天后,獲得抗性細(xì)胞克隆,進(jìn)一步通過96孔細(xì)胞培養(yǎng)板分離得到來(lái)源于單個(gè)轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞的細(xì)胞克隆,經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè),得到穩(wěn)定整人GlcCerase基因的轉(zhuǎn)基因供體細(xì)胞8株,和對(duì)照組細(xì)胞比較,轉(zhuǎn)基因過程中沒有導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)和核型異常。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的核型(2n=58+XX)正常比例為66.8％,而第10～12代的非轉(zhuǎn)染細(xì)胞核型正常率為70.9％,二者差異不顯著(P>0.05)。這些結(jié)果表明可以利用這些陽(yáng)性轉(zhuǎn)基

12、因細(xì)胞作供體細(xì)胞進(jìn)行核移植研究。
　　 第五部分:人GlcCerase轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的制備研究,采集屠宰山羊卵巢,獲取卵母細(xì)胞并體外成熟培養(yǎng),成熟率為63.3％。以100％匯合2天的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞作核供體,以去核的MⅡ期卵母細(xì)胞作核受體進(jìn)行核移植操作。完成核移植的卵母細(xì)胞采用122 kV/cm、20μs/次、間隔1 s的直流電脈沖進(jìn)行融合,融合率為83.3％,融合后的重構(gòu)胚胎進(jìn)一步用Ionomycin和6-DMAP進(jìn)行激活處理,然

13、后轉(zhuǎn)移到SOFaa培養(yǎng)液中與單層卵丘細(xì)胞共培養(yǎng),重構(gòu)胚的卵裂率為89.1％,發(fā)育至桑葚胚/囊胚期的比例為36.4％。以正常體細(xì)胞來(lái)源的核移植胚胎作為對(duì)照,其融合率、卵裂率以及桑葚胚/囊胚率分別為77.8％、90.9％和38.9％,兩種供體細(xì)胞來(lái)源的融合率和胚胎發(fā)育率差異不顯著。手術(shù)法將發(fā)生卵裂且形態(tài)正常的轉(zhuǎn)基因克隆胚(2-細(xì)胞期或以上)移植到同期發(fā)情的山羊輸卵管中,16只受體山羊中有6只一直沒有返情,在第40天經(jīng)B超檢測(cè)到2只妊娠的結(jié)果

14、,但是最終妊娠沒有發(fā)育到期,胎兒發(fā)生流產(chǎn)。
　　 第六部分:探討了外源基因轉(zhuǎn)染對(duì)供體細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。將構(gòu)建的乳腺表達(dá)載體pBC1-GlcCerase-Neo分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的奶山羊乳腺上皮細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞以及成年皮膚成纖維細(xì)胞,獲得整合有外源基因GlcCerase的轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞。以非轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞為對(duì)照,利用流式細(xì)胞儀分析了轉(zhuǎn)基因奶山羊體細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡的情況,研究結(jié)果顯示:三種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞100％匯合2 d

15、后,G0/G1細(xì)胞的百分比都顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05),其中轉(zhuǎn)基因胎兒成纖維細(xì)胞的G0/G1期比例高于其它兩種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；轉(zhuǎn)基因胎兒成纖維細(xì)胞凋亡率達(dá)22.56％,較對(duì)照組細(xì)胞有顯著提高(P<0.05)；然后進(jìn)一步利用熒光定量PCR法探討了外源基因轉(zhuǎn)染對(duì)胎兒成纖維細(xì)胞基因表達(dá)模式的影響,檢測(cè)的基因分別為基因印記基因(IGF2,IGF2R)、凋亡相關(guān)基因(Bax)、應(yīng)激相關(guān)基因(熱休克蛋白,Hsp70.1)、細(xì)胞連接相關(guān)基因(Cx