一株產(chǎn)纖維素酶細菌的分離及其β-葡萄糖苷酶基因克隆.pdf

1、纖維素是自然界中含量最豐富的生物量。據(jù)估計，全球每年通過光合作用產(chǎn)生近千億噸的纖維素類物質(zhì)。但目前人們對纖維素的利用還非常有限，大量的天然纖維素資源仍因無法分解利用而丟棄。同時纖維素的結(jié)構(gòu)特性也使得用纖維素酶直接降解纖維素的研究具有很大困難，這也為纖維素的高效性生物降解研究帶來了很大難題。有鑒于此，研究高效降解纖維素的微生物菌株具有重要的意義。 在天然纖維素降解過程中，微生物產(chǎn)生的纖維素降解酶具有決定性作用。纖維素降解酶包括三類

2、：從纖維素長鏈的內(nèi)部隨即切割的內(nèi)切型葡聚糖酶、從其非還原性末端依次切下兩個糖基的外切型葡聚糖酶、以及從纖維素寡糖(主要是二聚體)的非還原端依次切下一個糖基的外切型β-葡萄糖苷酶。目前的研究認為，β-葡萄糖苷酶在纖維素的降解速率中起到關(guān)鍵性調(diào)控作用。提高β-葡萄糖苷酶的活力能夠提高纖維素酶的降解效率，這對于纖維素的降解利用具有重要意義。 本研究以獲得新型β葡萄糖苷酶基因為目標，首先篩選分離到一株β-葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株，隨后圍繞菌

3、株的分類鑒定、β-葡萄糖苷酶基因克隆、酶家族分類和酶學(xué)性質(zhì)等方面進行了一系列的探討研究。 一、纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選 用cMCNa平板篩選方法，從花腐敗殘余物中篩選出五株纖維素酶活性較高的菌株。然后結(jié)合β-葡萄糖苷酶平板篩選法，從中選出一株β葡萄糖苷酶活性最強菌株，編號SWU-27。經(jīng)初步發(fā)酵，提取菌株SWU-27胞外粗酶液，測定該菌株產(chǎn)胞外型內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶酶活力，測定的活性結(jié)果分別為10.66

4、3U//mL、15.910U/mL、和20.107U/mL，其中β-葡萄糖苷酶酶活力最高，且占總活力的43.07％。 二、纖維素酶產(chǎn)生菌SWIJ-27的分類鑒定 通過菌體個體形態(tài)特征、菌落特征和生理生化試驗結(jié)果，并結(jié)合16S rDNA序列分析，對該菌株進行了分類鑒定。SWU-27菌體為桿狀、無鞭毛、不能運動、無芽孢、無伴孢晶體、革蘭氏染色呈陰性。對其12項生理生化指標進行了測定，結(jié)果與克雷伯氏桿菌屬的特征相符。

5、同時，該菌株的16S rDNA序列與Klebsiella sp.strain zlmy的16S rDNA序列有99.0％的同源性。且系統(tǒng)進化樹表明，此菌株和克雷伯氏桿菌屬的細菌具有較進的遺傳距離。因此，綜合各項指標的鑒定結(jié)果，我們將SWU-27菌株歸屬于克雷伯氏桿菌屬，并將其命名為Klebsiella sp.SWU-27。 三、β-葡萄糖苷酶基因的克隆及分析 提取SWU-27菌株全基因組DNA，以大腸桿菌為表達宿主菌，通

6、過鳥槍法，構(gòu)建全基因組文庫，從該菌株的基因組中克隆到一個新的β－葡萄糖苷酶基因nglu02.nglu02基因含有一個1230個堿基的ORF，編碼409個氨基酸，預(yù)測的pI值為8.90。HCA位點同源性分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，該基因?qū)儆诶w維素酶Ⅰ家族，與Ruminococcus flavefaciens celA的進化距離較近。nglu02氨基酸序列保守區(qū)和非保守區(qū)中分別存在谷氨酸和天冬氨酸等活性氨基酸殘基。 四、β-葡萄糖苷酶

7、酶學(xué)性質(zhì)初探 以同批發(fā)酵培養(yǎng)提取上清液為酶液，探索不同條件下該β-葡萄糖苷酶的活力。測定研究結(jié)果顯示：該β-葡萄糖苷酶反應(yīng)的最適pH為10.0左右，在pH11.0仍保持80％的酶活力。該酶的活性在中性和堿性環(huán)境下較穩(wěn)定，但在酸性環(huán)境下較容易失活。反應(yīng)的最適溫度為30℃左右，在5℃-70℃之間能保持50％以上的酶活力，這說明該酶具有較好的溫度穩(wěn)定性。金屬離子和表面活性劑等對該酶具有不同程度的抑制影響能力。其中酶對K+、Na+、Cu