深海細(xì)菌Exiguobacterium oxidotolerans A011β-葡萄糖苷酶基因的克隆、表達(dá)與酶學(xué)分析.pdf

1、β-葡萄糖苷酶在自然界分布廣泛，幾乎在所有生物體中都能夠找到，它們參與生物體的糖代謝，因其來源不同而性質(zhì)各異，對維持生物體正常生理功能起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶參與EMP糖酵解途徑，是雙歧桿菌糖代謝的相關(guān)酶系之一。在纖維素的糖化作用中，β-葡萄糖苷酶的功能是協(xié)助其它酶，將纖維二糖和纖維素寡糖水解成葡萄糖。人和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的乳糖酶/根皮苷(LPH)水解酶也含有一種芳基-β-葡萄糖苷酶，LPH因其涉及成人型乳糖酶缺乏病-一種常見

2、的人體基因紊亂病而受到廣泛關(guān)注。此外，β-葡萄糖苷酶能將瓜果、蔬菜、茶中的風(fēng)味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)。因此對β-葡萄糖苷酶的研究具有重要的理論和實(shí)用價(jià)值。
　　 本文從廈門海洋三所提供的海洋細(xì)菌中篩選得到一株具有較高β-葡萄糖苷酶活性的微小桿菌(ExiguobacteriumoxidotoleransA011)，通過鳥槍法構(gòu)建文庫，首次完成了該菌的β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)基因的克隆以及原核表

3、達(dá)，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)以pUC18為克隆載體，克隆得到的β-葡萄糖苷酶基因（bgllc）全長1347bp，編碼488個(gè)氨基酸，預(yù)測的蛋白分子量為51.6kDa。該酶同其它已知β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列的最高同源性為68％，屬于糖苷水解酶第1家族。以pGEX-6p-1為表達(dá)載體，將bgllc連在載體上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8個(gè)小時(shí)后表達(dá)良好。以pNPGlu為底物，對該酶進(jìn)行了性質(zhì)分析，分別測定了其最適pH值及最適溫

4、度、pH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性，以及金屬離子和化學(xué)試劑對酶活的影響。BgllC的最適反應(yīng)pH為7，在pH6.6-9之間較穩(wěn)定，最適反應(yīng)溫度為35℃，Na+，Ca2+，EDTA以及β-mercaptoethanol對其活性幾乎沒影響，而Hg+，Cu2+，Co2+則強(qiáng)烈抑制其活性。該酶能使纖維二糖，三糖，四糖部分降解，且同時(shí)具有較高β-半乳糖苷酶活性，是一個(gè)雙功能酶。值得一提的是BgllC在低溫時(shí)仍具較高活性，是一個(gè)冷活性β-葡萄糖苷酶。這些優(yōu)良