未培養(yǎng)細菌β—葡萄糖苷酶基因的克隆、表達及酶學(xué)性質(zhì)的初步研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、β-葡萄糖苷酶是纖維素酶系中的一種，是纖維素降解的限速酶。因此，通過構(gòu)建基因工程菌以促進β-葡萄糖苷酶的表達，是實現(xiàn)纖維素高效降解的有用途徑。 構(gòu)建未培養(yǎng)細菌的宏基因組文庫是新興的篩選新型基因的有效方法。在本研究中，采用β-葡萄糖苷酶活性篩選策略，從未培養(yǎng)堿性污染物宏基因組AL01文庫中篩選到3個編號分別為pGXAG142、pGXAG313和pGXAG805的陽性克隆。對它們進行DNA測序后進行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，這3個

2、克隆的外源片段分別包含有783 bp、510bp和1443bp的ORF，分別編碼281、170、481個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，pI/Mw分別為4.88/29079.25kDa、6.28/18513.32 kDa、5.16/57383.4 kDa。BLAST軟件分析這3個基因與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中的β-葡萄糖苷酶基因沒有任何DNA或者氨基酸水平的同源性，可能是新型的β-葡萄糖苷酶編碼基因。PCR擴增這3個基因的ORF后將它們分別亞克隆到表達載體pE

3、TBlue-2上，然后轉(zhuǎn)化至EColi Rosetta(DE3)plysS，平板酶活檢測顯示它們?nèi)阅芙到獾孜?，說明均攜帶了正確的讀碼框架。 以大腸桿菌表達菌株pGXAG142G/Rosetta(DE3)plysS的表達蛋白Bglg142為主要研究對象，對其進行了酶學(xué)性質(zhì)的初步研究，發(fā)現(xiàn)該酶的最適pH為5.5-8.0，最佳作用溫度為50℃，Km值為0.238 mmol/L，Vmax為10.6 U/min，最適條件下酶活為 24.8

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