腸球菌中β-D-葡萄糖苷酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、銀杏提取物(EGb761)含有24％銀杏黃酮內(nèi)酯(Ginkgo-flavone glycosides)及6％萜類化合物(Terpenoids),它可望成為治療阿爾茲海默病(Alzheimer'sdisease,AD)的有效藥,但是其臨床前期試驗(yàn),包括代謝等還沒有能夠按照藥物研發(fā)的現(xiàn)代標(biāo)準(zhǔn)來(lái)進(jìn)行。銀杏提取物的代謝主要是通過(guò)腸道微生物菌群分泌的水解酶來(lái)進(jìn)行的,由此,本文選定腸球菌為模式菌株,通過(guò)系列研究不但能夠初步闡明機(jī)體代謝吸收銀杏提取物

2、中主要有效成分的酶學(xué)及分子生物學(xué)的機(jī)制,而且為按照現(xiàn)代藥物標(biāo)準(zhǔn)研發(fā)銀杏系列產(chǎn)品做好方法上的準(zhǔn)備并提供理論依據(jù),因此具有理論研究和實(shí)際應(yīng)用雙重重要意義。目前,國(guó)內(nèi)外尚未見此方面成功的研究報(bào)道。
　　 首先通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化設(shè)計(jì)得到了腸球菌最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖1.87896％、酵母膏0.77474％、牛肉膏0.3％、蛋白胨1％、KNO36.25 mmol/L、NaCl0.5％,最適培養(yǎng)條件為:裝液量60 mL、初始pH7.0、接種

3、量3％、溫度36℃,接種后置于170 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)20 h后,于OD560處測(cè)定吸光度值為0.748,比優(yōu)化前的0.682提高了9.7％。
　　 其次確定了腸球菌中β-D-葡萄糖苷酶的酶活測(cè)定方法:在10mL具塞比色管中加入1.5 mL pH5.0的0.02 mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液,再用適當(dāng)刻度的移液槍吸取0.1 mL粗酶提取液加入其中,于45℃恒溫水浴中預(yù)熱一定時(shí)間,再加入已預(yù)熱5～10 min的0.4

4、 mL1 mmol/L底物pNPG溶液,用秒表精確計(jì)時(shí),14 min后取出立即加入42 mL1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應(yīng),在比色管架上冷卻至室溫,于400nm處測(cè)光吸收值。
　　 再次通過(guò)單因素和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)腸球菌產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的最佳配比為:玉米粉3％,酵母浸粉1.2％,蛋白胨1％,葡萄糖2％,K2HPO40.1％,MgSO47.5 mmol/L；相應(yīng)的最佳腸球菌產(chǎn)酶發(fā)酵條

5、件為:初始pH7.0,發(fā)酵溫度37℃,發(fā)酵時(shí)間168 h,搖床轉(zhuǎn)速180 r/min,裝液量50 mL(250 mL三角瓶),接種量為3％,此時(shí)腸球菌產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的酶活最高,達(dá)到19.1242 U/(mL·min)。
　　 腸球菌產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶發(fā)酵液經(jīng)過(guò)40％～80％硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-纖維素52陰離子交換層析、Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析等步驟分離純化得到了β-D-葡萄糖苷酶純品,該酶的比活力由

6、3.37 U/mg提高到33 U/mg,純化倍數(shù)為9.79倍,且酶的回收率為5.33％。提純酶蛋白經(jīng)NATURE-PAGE和SDS-PAGE電泳,確定來(lái)源于腸球菌的β-D-葡萄糖苷酶相對(duì)分子量約為121KD,由兩個(gè)亞基組成(65KD和54KD)。提純后的β-D-葡萄糖苷酶經(jīng)酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)酶耐酸性較強(qiáng),具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性。5 mmol/L的Mg2+、Ba2+、Ca2+對(duì)β-葡萄糖苷酶有激活作用；而Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ag+對(duì)酶