β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化及β-葡萄糖苷酶應(yīng)用研究.pdf

1、β-葡萄糖苷酶是纖維素酶的一個關(guān)鍵組分，在纖維素降解中起重要作用。其酶活的高低直接影響纖維素的降解效率。他們還能將果、蔬、茶中的風(fēng)味前體物質(zhì)水解為具有濃郁天然風(fēng)味的香氣物質(zhì)，用于食品和飲料工業(yè)中。但就目前已知的纖維素酶產(chǎn)生菌株來看，其β-葡萄糖苷酶的酶活普遍偏低，對這些菌株進(jìn)行分子改造又耗時耗力。從自然界中直接篩選β-葡萄糖苷酶酶活較高的出發(fā)菌株，是獲得β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株的最直接有效的方法。 本論文主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：

2、 1．本論文受到細(xì)菌“膽汁-七葉苷”實驗的啟發(fā)，改造發(fā)明了一種快速、高效的篩選β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的方法-七葉苷平板法，利用這種方法，從富含腐爛秸稈的土壤中篩選得到了13株具有β-葡萄糖苷酶活力的菌株。通過酶活測定，其中3株酶活較高，主要對其中酶活最高的一個菌株P(guān)eni-1進(jìn)行了研究。首先通過形態(tài)觀察和18S rDNA序列分析，將該菌株鑒定為斜臥青霉。 2．為了進(jìn)一步提高該菌株的酶活，本論文對該Perni-1菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

3、基和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，通過單因子和正交實驗，得到了最佳培養(yǎng)基配比，即麥麩3．0％，草粉3．0％，微晶纖維素0．6％，（NH4）2SO40．4％，KH2PO40．1％，MgSO40．05％，CaCl20．05％，微量離子液1．0 ml/L培養(yǎng)基；最佳培養(yǎng)條件為：裝液量為50 ml（300 ml錐形瓶），搖床轉(zhuǎn)速，200 r/min，培養(yǎng)溫度，30℃。培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化后使得該菌株的酶活較優(yōu)化前提高了4倍，在發(fā)酵第6d時達(dá)到15．3 I

4、U/ml。這較文獻(xiàn)中報道的青霉、曲霉、木霉以及其它菌株的β-葡萄糖苷酶酶活都有明顯的優(yōu)勢。 3．論文還對該菌株所產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，酶促反應(yīng)的最適溫度測定結(jié)果表明，該酶的最適反應(yīng)溫度為70℃，在此溫度下β-葡萄糖苷酶的酶活達(dá)到44．3 IU/ml，較在原來測定溫度下（50℃）的酶活提高了將近2倍，且該酶在0～70℃都具有很好的熱穩(wěn)定性。這較文獻(xiàn)已報到的β-葡萄糖苷酶的熱穩(wěn)定性高出很多，酶促反應(yīng)的最適pH測定

5、結(jié)果表明，該酶反應(yīng)的最適pH為4．5，這與文獻(xiàn)已報到的曲霉、木霉等菌株的β-葡萄糖苷酶最適pH相似，且在pH3．0～10．0之間有很好的穩(wěn)定性。 4．為了從分子水平研究該菌株酶活較高的原因，對該菌株的β-葡萄糖苷酶基因全序列進(jìn)行了克隆。并與實驗室菌株斜臥青霉JU-A10的β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行比較，找出了這兩個菌株的酶基因序列上的差異，為以后的研究提供了參考。 5．β-葡萄糖苷酶除了作為纖維素酶的一個關(guān)鍵組分在纖維素降解

6、中起重要作用以外，還廣泛應(yīng)用與其它領(lǐng)域，如食品增香，果酒增香等。本文將β-葡萄糖苷酶應(yīng)用于中藥虎杖中自藜蘆醇苷的水解，是β-葡萄糖苷酶應(yīng)用的一個嶄新領(lǐng)域。絕大多數(shù)植物中的天然糖苷都是β-糖苷，虎杖中的白藜蘆醇苷也不例外，β-葡萄糖苷酶能夠快速、高效的將白藜蘆醇苷水解為白藜蘆醇和葡萄糖，且白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率在90％以上。 在大規(guī)模工業(yè)中應(yīng)用β-葡萄糖苷酶水解白藜蘆醇苷，其成本是一個重要限制性因素，固定化酶在提高工業(yè)酶的生產(chǎn)穩(wěn)定性方

7、面具有很大的優(yōu)勢。本論文應(yīng)用固定化的β-葡萄糖苷酶來水解虎杖樣品，同樣能夠達(dá)到很好的水解效果。固定化的β-葡萄糖苷酶具有很好的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，使用同一批固定化酶對虎杖進(jìn)行水解，連續(xù)水解6次，白藜蘆醇苷的轉(zhuǎn)化率均保持在85％以上。 本論文還初步研究了白藜蘆醇的提取方法，白藜蘆醇微溶于水，易溶于乙醇，甲醇、丙酮等有機(jī)溶劑。由于乙醇在經(jīng)濟(jì)上和安全性上都優(yōu)于其它試劑，所以本文采用乙醇回流法提取經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解的虎杖樣品，將95％