蚓激酶山羊乳腺生物反應(yīng)器研究及其表達(dá).pdf

1、該課題為國家"863"生物反應(yīng)器重大專項(2002AA206653)—蚓激酶山羊乳腺生物反應(yīng)器研究,最終目的為通過基因工程手段建立蚓激酶轉(zhuǎn)基因山羊乳腺生物反應(yīng)器,實現(xiàn)由羊乳中表達(dá)蚓激酶,直接飲用羊乳就可以達(dá)到治療血栓和保健的目的.目前已完成了蚓激酶在山羊乳腺中的暫時表達(dá)并已檢測出其纖溶活性,蚓激酶在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)研究和將蚓激酶逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染山羊乳腺并整合表達(dá)這部分工作.血栓性疾病的發(fā)病率和死亡率均較高,并呈現(xiàn)逐年上升趨勢.迄今

2、為止,人們從多種生物組織、體液中提取到了各種溶栓酶,如尿激酶、鏈激酶和蝮蛇抗栓酶等,并已經(jīng)開發(fā)成抗血栓類藥物.但由于這些藥物的原料非常的缺乏,如每升人尿中含有尿激酶一萬分之五克,從而導(dǎo)致藥價非常昂貴,而且這些藥物在臨床應(yīng)用上存在各種各樣的問題,如容易失活、體內(nèi)停留時間短暫及導(dǎo)致出血等缺陷.大量的研究及藥效學(xué)實驗證明,蚯蚓的蛋白提取物蚓激酶具有明顯的防止血液凝集、抑制血栓形成及溶血栓作用.口服劑型的粗提蚓激酶制劑已在臨床上得到應(yīng)用,療效可

3、靠,如百奧蚓激酶膠囊、博洛克等.(1)蚓激酶乳腺組織特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其在山羊乳腺中的暫時表達(dá).以合成的蚓激酶cDNA突變體為目的基因,以pGEM-T-bCP、pIRESlneo和pMD18-T-LK為原始質(zhì)粒,經(jīng)系列酶切、連接和轉(zhuǎn)化后得到以山羊β-酪蛋白啟動子為上游調(diào)控序列的乳腺組織特異性表達(dá)載體pIbCP-LK-neo和含有兩個目的基因拷貝的表達(dá)載體pIbCP-LK-LK.以山羊乳腺作為生物反應(yīng)器,在穩(wěn)定泌乳期于乳腺組織分別注射

4、以上兩種表達(dá)質(zhì)粒,采集乳汁,通過纖維蛋白平板溶圈試驗進(jìn)行纖溶活性測定.結(jié)果顯示,注射了蚓激酶表達(dá)質(zhì)粒的山羊奶具有明顯的纖溶活性;pIbCP-LK-LK蚓激酶在奶中的表達(dá)量高于pIbCP-LK-neo.經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分析表明,表達(dá)的蚓激酶分子量為26kDa.該試驗系首次實現(xiàn)了蚓激酶在山羊乳腺中的基因工程暫時表達(dá),為通過轉(zhuǎn)基因途徑生產(chǎn)蚓激酶奠定了基礎(chǔ).(2)蚓激酶基因在Vero細(xì)胞及DK細(xì)胞中的表達(dá).以巨細(xì)胞病毒C