家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)人GM-CSF的研究.pdf

1、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子是一種在體外調(diào)控粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞分化、增殖和存活的造血性糖蛋白細(xì)胞因子。本研究成功地利用家蠶核型多角體桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶蛹中表達(dá)并純化出重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子。 通過RT-PCR技術(shù)，我們利用一對(duì)特異引物從人胚纖維原細(xì)胞中擴(kuò)增到人GM-CSF基因。將擴(kuò)增的GM-CSFPCR產(chǎn)物用EcoRI和BamHI酶切后插入到同樣酶切的家蠶桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pUBM-4中，從而構(gòu)成了重組載體pBM

2、-CSF。將該質(zhì)粒與線性化的Bm-BacPAK6DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞BmN，在培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞中挑出空斑，經(jīng)過3輪純化，獲得重組病毒vBm-CSF。 我們利用重組病毒vBm-CSF感染家蠶蛹來表達(dá)重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子。經(jīng)SDS-PAGE和Westernblotting鑒定表明在重組病毒感染的家蠶蛹體內(nèi)存在重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子。表達(dá)產(chǎn)物分子量約為29kDa，在蠶蛹中的表達(dá)量約為97μg/蛹；在蠶蛹粗提物中的r

3、hGM-CSF生物活性約為6.8×106cfu/mg。 與以前在家蠶細(xì)胞和幼蟲中分泌表達(dá)的hGM-CSF相比，我們?cè)诩倚Q蛹表達(dá)的hGM-CSF表現(xiàn)出較大的差異：分子量較大、表達(dá)量和生物活性偏低，這可能與蛋白的翻譯后修飾有關(guān)。因而，有必要對(duì)蠶蛹表達(dá)的hGM-CSF進(jìn)行大量表達(dá)和純化以鑒定該表達(dá)產(chǎn)物的相關(guān)理化性質(zhì)。為此，我們將重組病毒接種了大量的蠶蛹來表達(dá)hGM-CSF。通過硫酸銨分級(jí)沉淀、凝膠排阻過濾和離子交換層析多步純化，最終我

4、們以10.5％的得率從700頭接種重組病毒的家蠶蛹中獲得3.5mg純度達(dá)97％的蠶蛹表達(dá)產(chǎn)物Bm-hGM-CSF。經(jīng)檢測(cè)，高純度的表達(dá)產(chǎn)物Bm-hGM-CSF生物活性達(dá)約8.4×106cfs/mg。 對(duì)純化的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行理化性質(zhì)分析。等電聚焦電泳表明，家蠶蛹表達(dá)產(chǎn)物Bm-hGM-CSF等電點(diǎn)約為5.1，與家蠶細(xì)胞和幼蟲中表達(dá)hGM-CSF很接近；肽譜分析發(fā)現(xiàn)，Bm-hGM-CSF與原核hGM-CSF在肽譜的表現(xiàn)上非常相似；去糖基