大豆生物反應(yīng)器表達(dá)融合蛋白CTB-LK.pdf

1、用植物表達(dá)藥物蛋白具有很多優(yōu)勢，這些優(yōu)勢包括：較低的生產(chǎn)成本，儲存和運(yùn)輸成本，熱穩(wěn)定性，不受人類病原生物污染，植物細(xì)胞的細(xì)胞壁作為生物保護(hù)膜，保護(hù)蛋白藥物通過人體的胃部酸性不利環(huán)境，由于口服給藥從而免去了注射劑的純化及相關(guān)設(shè)備的消毒。盡管如此，植物表達(dá)的藥物蛋白不易為人體的腸道所吸收，這一點(diǎn)成為這種藥物有效給藥的一大障礙。受體介導(dǎo)的口服給藥系統(tǒng)為這一問題提了可能的解決辦法。 本研究利用霍亂毒素B-亞基(cholera toxin

2、 B-subunit，CTB)作為腸道黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)載體，輔助藥物蛋白穿過腸上皮細(xì)胞的運(yùn)輸，我們將CTB基因和蚓激酶(Lembrokinase，LK)的基因通過一段柔性連接肽相連，并使其在大豆細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。蚓激酶(LK)是一種從蚯蚓體內(nèi)提出來的纖維蛋白酶，被廣泛用作溶血栓藥物。我們將CTB-LK融合基因克隆到植物表達(dá)載體pBI121內(nèi)，并導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株C58內(nèi)。 我們從幾個(gè)方面改進(jìn)了傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆子葉節(jié)法轉(zhuǎn)化體系。為得到高質(zhì)量的

3、子葉節(jié)外植體，我們改進(jìn)了滅菌方法，用鹽酸和次氯酸鈉混合制得的氯氣干法滅菌代替?zhèn)鹘y(tǒng)的溶液滅菌。為了提高轉(zhuǎn)化效率，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基內(nèi)添加巰基類化合物，這種化合物能抑制植物對抗農(nóng)桿菌的防衛(wèi)反應(yīng)導(dǎo)致的組織壞死，從而改善了T-DNA的轉(zhuǎn)移。我們將生根培養(yǎng)基中生長素IBA的濃度降低到0.2mg/L，從而改善了生根率。 經(jīng)過了不定芽誘導(dǎo)，不定芽的伸長和生根過程，得到了22株具有卡那霉素抗性的大豆小苗。經(jīng)PCR方法驗(yàn)證了有2株幼苗呈現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽性。