家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)的BmrhGM-CSF膠囊Ⅰ期臨床試驗(yàn)及口服吸收機(jī)制的研究.pdf

1、人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(hGM-CSF)是一種酸性糖蛋白，含有127個(gè)氨基酸殘基，其重組蛋白rhGM-CSF可以在大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，rhGM-CSF分子量從14.4到32kDa不等。rhGM-CSF具有促進(jìn)骨髓造血前體細(xì)胞增殖的作用，刺激粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的集落形成和增生。該重組蛋白最初用于骨髓移植、腫瘤化療及艾滋病相關(guān)的中性粒細(xì)胞缺乏癥。目前，rhGM-CSF是以注射劑的形式應(yīng)用于臨床，有一定的局限性以

2、及劑型引起的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)室利用家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)研制了重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(BmrhGM-CSF)口服膠囊，分子量為29kDa，臨床前研究表明BmrhGM-CSF在體內(nèi)外均具有生物學(xué)活性：在體外可以促進(jìn)人骨髓干細(xì)胞集落形成；體內(nèi)試驗(yàn)證明給小鼠、狗和獼猴灌胃BmrhGM-CSF后可以吸收入血并且發(fā)揮細(xì)胞因子的功能：(1)小鼠口服BmrhGM-CSF后，明顯促進(jìn)脾臟表面造血灶的形成和骨髓DNA的合成；(2)60Co

3、輻照導(dǎo)致造血功能抑制的比格犬口服BmrhGM-CSF后第9天白細(xì)胞數(shù)目恢復(fù)到基值的50％，到第12天恢復(fù)到正常水平；(3)經(jīng)環(huán)磷酰胺化療的獼猴口服BmrhGM-CSF后，相對空白對照組，其白細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，其療效與注射劑rhGM-CSF相似。
　　 基于上述工作的基礎(chǔ)，本論文開展以下兩部分研究：一是BmrhGM-CSF膠囊Ⅰ期臨床試驗(yàn)，二是BmrhGM-CSF膠囊口服吸收機(jī)制的研究。一、BmrhGM-CSF膠囊Ⅰ期臨床試驗(yàn)<

4、br>　　 為探索BmrhGM-CSF膠囊單劑量用藥安全性，選擇健康受試者27例，分成5個(gè)劑量組：150ug、300ug、600ug、750ug、900ug，口服給藥一次，按照劑量由低到高的順序安排試驗(yàn)，試驗(yàn)期間需觀察前一個(gè)劑量組不產(chǎn)生明顯的藥物不良反應(yīng)，才進(jìn)行下一個(gè)劑量組試驗(yàn)。經(jīng)過臨床觀察以及尿液、血生化、心電圖等指標(biāo)的檢查表明：BmrhGM-CSF膠囊單次用藥在900ug以下為安全劑量范圍，沒有發(fā)生與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。
　

5、　 為研究BmrhGM-CSF膠囊藥效學(xué)，采取兩種試驗(yàn)方案，一是選擇14例實(shí)施化療的腫瘤患者，分成2個(gè)劑量組：150μg和300μg，一天口服2次，連續(xù)14天，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)現(xiàn)BmrhGM-CSF膠囊在上述兩個(gè)劑量下多次給藥后沒有發(fā)生與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，而且口服BmrhGM-CSF膠囊后可以預(yù)防因化療導(dǎo)．致的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞下降。另外一種方案是將48例腫瘤放、化療病人隨機(jī)分成2組：口服BmrhGM-CSF膠囊組（39人）以及安慰

6、劑對照組（9人）；口服BmrhGM-CSF組于放化療后第三天口服BmrhGM-CSF:一次300μg，一天2次，連續(xù)12天；安慰劑對照組于放化療后第三天口服安慰劑：一次2粒，一天2次，連續(xù)12天。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在安慰劑組，給藥后第3天白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞均開始下降，到第9天白細(xì)胞數(shù)目下降到最低值為3.31×109/L、中性粒細(xì)胞數(shù)目為1.53×109/L;而在口服BmrhGM-CSF膠囊組，給藥后第9天白細(xì)胞數(shù)目和中性粒細(xì)胞數(shù)目分別為4.61

7、×109/L和2.32×109/L。上述結(jié)果表明口服BmrhGM-CSF膠囊能夠改善腫瘤病人因放化療引起的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞下降的癥狀。
　　 根據(jù)雙處理、雙周期、兩序列的隨機(jī)交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，選擇19例志愿者，口服BmrhGM-CSF8μg/kg或皮下注射大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF3.75μg/kg，給藥后按Oh、0.5h、0.75h、1.0h、1.5h、2.0h、3.0h、4.0h、5.0h、6.0h、8.0h、10.0

8、h、12.0h肱靜脈取血，ELISA法測定血液中hGM-CSF濃度，結(jié)果表明19人口服BmrhGM-CSF后，有15人血液中檢測到與正常血漿有顯著差異的血藥濃度，用梯形面積法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積AUC，根據(jù)試驗(yàn)品的AUC與參比品的AUC比值計(jì)算相對生物利用度得出BmrhGM-CSF經(jīng)口服后在15人中有效吸收的平均生物利用度為1％，最高為3.1％。二、BmrhGM-CSF膠囊口服吸收機(jī)制的研究
　　 BmrhGM-CSF經(jīng)125Ⅰ標(biāo)

9、記后，按10μg/kg、50μg/kg的劑量給ICR小鼠灌胃，給藥后在不同的時(shí)間收集尿液檢測放射活性，結(jié)果表明，口服125Ⅰ-BmrhGM-CSF8h后，經(jīng)尿液排出大約18％的125Ⅰ總放射活性。同時(shí)在口服125Ⅰ-BmrhGM-CSF30min后采血，離心析出血清，SDS-PAGE電泳后放射自顯影，在高劑量組(50ug/kg)出現(xiàn)一條有125Ⅰ放射性的條帶，大小約18～20 kDa，這條帶為125Ⅰ-BmrhGM-CSF的部分降解產(chǎn)物

10、，低劑量組沒有出現(xiàn)125Ⅰ放射性的條帶，說明125Ⅰ-BmrhGM-CSF可以吸收入血。
　　 SD大鼠灌胃50μg/kg,10μg/kg的BmrhGM-CSF，給藥后15min在大鼠血清中可檢測到GM-CSF。兩組大鼠在給藥后30min時(shí)內(nèi)血清中GM-CSF濃度達(dá)到最高值分別是1010ng/L、212ng/L，然后逐漸下降，一直維持到12h，12h后所有大鼠血漿中均無法測出GM-CSF。說明SD大鼠口服BmrhGM-CSF膠囊

11、后可以被吸收入血。
　　 設(shè)計(jì)自身交叉試驗(yàn)，取3名志愿者口服BmrhGM-CSF或注射rhGM-CSF后Oh，lh，2h，3h，4h后的血清樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析(Q-Trap MS/MS TOF)，對各取樣點(diǎn)進(jìn)行EMS掃描，得出各點(diǎn)的一級譜圖，以O(shè)h為參照點(diǎn)，其它點(diǎn)分別與之比較，得出差異峰，對差異峰進(jìn)行EPI掃描，進(jìn)而得出此差異峰的分子量及其可能的氨基酸序列。以O(shè)h的血清樣本的MS數(shù)據(jù)為對照，在其余不同時(shí)間EM峰中找出差異峰，并對這

12、些差異峰作進(jìn)一步分析。根據(jù)分子量建立的肽圖譜表明，在差異峰中存在hGM-CSF肽片段，這些大小不同的多肽分子量范圍是2039到7336Da，證明通過口服，BmrhGM-CSF可以經(jīng)腸道吸收進(jìn)入血液。
　　 將蠶蛹凍干粉與大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF混合給小鼠灌胃，結(jié)果證明小鼠灌胃這種混合物后其血液中rhGM-CSF濃度升高。將蠶蛹勻漿，離心除去沉淀，將上層溶液置于分液漏斗，分離富脂蛋白層和蛋白質(zhì)層，制成凍干粉，分別作為載藥材料

13、包裹大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF并且給小鼠灌胃。試驗(yàn)結(jié)果表明將蠶蛹富脂蛋白層作為載藥材料包裹rhGM-CSF給小鼠灌胃后30min和60min的血藥濃度顯著上升，分別為98.73ng/L、106.28ng/L。將蠶蛹蛋白層作為載藥材料包裹rhGM-CSF給小鼠灌胃后30min和60min的血藥濃度也會上升，分別為48.73ng/L、76.25ng/L，說明蠶蛹富脂蛋白層和蛋白質(zhì)層均可以促進(jìn)rhGM-CSF的口服吸收，而且蠶蛹富脂蛋白層

14、作為載藥材料包裹rhGM-CSF的效果比蠶蛹蛋白層的要好。
　　 將大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF用蠶蛹富脂蛋白層包裹后給小鼠灌胃后取血清，用快速液相色譜(FPLC)的10 RI反相柱進(jìn)一步純化血清樣品的蛋白質(zhì)，按峰自動(dòng)收集，再利用MALDI-TOF MS進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口服rhGM-CSF的小鼠血清中存在14.5kDa的rhGM-CSF，其質(zhì)譜圖類似于皮下注射大腸桿菌表達(dá)的rhGM-CSF的小鼠血清質(zhì)譜圖。另外，用5％戊

15、二醛固定蠶蛹富脂蛋白層承載的rhGM-CSF于銅臺上，在掃描電子顯微鏡下觀察到蠶蛹富脂蛋白層包裹的rhGM-CSF樣品形成近似球形的微囊結(jié)構(gòu)，這種脂質(zhì)微囊具有脂溶性，它可能與小腸壁絨膜細(xì)胞膜融合，通過胞飲作用將rhGM-CSF微囊球通過生物膜內(nèi)陷形成細(xì)胞吞噬體而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，繼而將rhGM-CSF從小腸壁外轉(zhuǎn)運(yùn)到小腸壁內(nèi)。
　　 將蠶蛹蛋白通過Sephadex G-150分離柱的分離純化，我們收集到36管蛋白樣品。應(yīng)用Biaeor