山羊瘤胃和草魚腸道微生物分子生態(tài)研究及β-葡萄糖苷酶基因的克隆.pdf

1、動物胃腸道存在著大量的微生物群落,構(gòu)成了動物消化道微生物區(qū)系,這些微生物群落是動物長期進(jìn)化的結(jié)果,它們和機(jī)體的免疫功能、營養(yǎng)需求等都有著密切的關(guān)系.微生物生態(tài)的監(jiān)測及其群落多樣性分析是微生物生態(tài)學(xué)研究所采用的重要技術(shù)手段和內(nèi)容.基于核酸序列分析的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)可以用來檢測不可培養(yǎng)微生物的種類,完善微生物的分類系統(tǒng),從而更真實的反映環(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu).植食性動物胃腸道存在大量可降解纖維素和半纖維素的微生物,分泌并應(yīng)用大量纖維素降解酶

2、類.因此,對于植食性動物胃腸道微生物的分子生態(tài)、纖維素酶類多樣性及功能研究在理論研究和生產(chǎn)實踐中具有重要的意義. 本研究應(yīng)用變性梯度凝膠電泳技術(shù)研究動物胃腸道微生物分子生態(tài).利用16S rDNA,rpoB和原蟲18s rDNA基因的變性梯度凝膠電泳技術(shù)對三種山羊(波爾山羊、內(nèi)蒙古絨山羊、四川南江黃羊)瘤胃細(xì)菌以及原蟲的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析.研究結(jié)果顯示rpoB DGGE圖譜中條帶數(shù)目少于16s rDNA圖譜,并且條帶分離

3、效果明顯,更有利于分析瘤胃細(xì)菌群落組成.DGGE圖分析顯示,三種山羊瘤胃細(xì)菌均具有一定的相似性,種內(nèi)個體間相似性明顯高于種間相似性,這說明宿主品種是影響瘤胃細(xì)菌種群構(gòu)成的一個重要因素.而原蟲種內(nèi)相似性并不高于種問相似性. 利用同樣方法對草魚腸道不同區(qū)段優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析.研究結(jié)果表明消化道存在著豐富多樣的細(xì)菌群落,對DGGE指紋圖譜聚類分析表明菌群組成相似性高于77﹪.其中中腸和后腸的細(xì)菌多樣性高于前腸,這可能與攝食餌

4、料在消化道推移有關(guān). 另外,以飼喂單一牧草的草魚腸道為研究對象,篩選到具有不同纖維素酶活性的菌株90多株.然后根據(jù)菌落形態(tài)和水解圈差異結(jié)合16S rDNA序列結(jié)果,最終分離到15株具有不同纖維素水解能力的細(xì)菌菌株.基于16s rDNA序列比對分析發(fā)現(xiàn),分離菌株分別屬于希瓦氏菌屬(Shewanella)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsie

5、lla)、變形桿菌屬(Proleus)、腸桿菌屬(Enterobacter)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter). 進(jìn)一步建立了一種快速篩選和評價屬于糖基水解酶家族1的β-葡萄糖苷酶編碼新基因的方法.p一葡萄糖苷酶是一種能夠水解結(jié)合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵的水解酶,在纖維素降解領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值.通過對發(fā)表酶氨基酸序列的同源比較,設(shè)計了一對簡并引物,利用同源克隆技術(shù),在15株細(xì)菌中克隆得到11條編碼β-葡萄糖

6、苷酶的基因片段,其相互之間氨基酸相似性在50﹪到98﹪之間.實驗結(jié)果證實了這種快速篩選基因方法的有效性. 通過基因組文庫篩選,從芽孢桿菌屬、氣單胞菌屬和變形桿菌屬中分別獲得了三個B一葡萄糖苷酶基因的全長序列,分別命名為bgl3,bgl5和bgl7,這三個基因同已注冊的葡萄糖苷酶基因序列的最高相似性分別為88﹪、72﹪和82﹪.它們與已報道的進(jìn)行過功能驗證的來源于Clostridiumcellulovorans的BglA氨基酸相