鴨源新城疫病毒分離鑒定、遺傳進(jìn)化分析及檢測(cè)方法的研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是由副粘病毒科腮腺炎病毒屬的新城疫病毒引起的高度接觸性傳染病。水禽曾被認(rèn)為是新城疫病毒的天然儲(chǔ)存庫(kù)，尤其是鴨，對(duì)ND有很強(qiáng)的抵抗力，一般鴨群中都潛伏有病毒，但不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀。但自從1999年來(lái)不斷有發(fā)生鴨源新城疫疾病的報(bào)道。
　　 2008-2010年從廣西不同活禽市場(chǎng)鴨群中分離純化了7株有血凝性的病毒，這7株病毒的血凝性均能被新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清抑制，而不能被禽流感多種H亞

2、型陽(yáng)性血清抑制，經(jīng)過(guò)HA、HI試驗(yàn)和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果，確定為新城疫病毒。7株病毒的雞胚平均致死時(shí)間(MDT)93.6h-162h，雞胚半數(shù)致死量(ELD50)為10-6.786/0.1mL-10-8.438/0.1mL，3株代表株的ICPI為0.15-0.30，推測(cè)該7株病毒為弱毒型NDV。
　　 為進(jìn)一步探討7株NDV鴨源NDV毒株GX16/2008、GX17/2009、GX18/2009、GX19/2009、GX20/2

3、010、GX21/2010和GX22/2010的分子病原學(xué)特征，運(yùn)用RT-PCR方法獲取了它們的全基因組序列，并對(duì)其進(jìn)行了比較分析。此7株病毒的全基因組序列均由15186個(gè)堿基組成，與GenBank公布的LaSota、B1、Clone30、Ireland Ulster67毒株的全基因組序列長(zhǎng)度相同。F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸序列表明所有的分離株都是無(wú)致病性的序列。7分離株中5株氨基酸順序?yàn)?12G-K-Q-G-R-L117，2株為112G-

4、R-Q-G-R-L117，繪制的進(jìn)化樹(shù)分析表明其中5株屬于NDVs基因Ⅰ型，2株屬于基因Ⅱ型。它們?cè)谌蚪M核苷酸和氨基酸水平上，發(fā)現(xiàn)與HM125898WDK/JX株相似性較接近，而與F48E8、Mukteswar等毒株的同源性較低。
　　 根據(jù)NDV F基因的8個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)能區(qū)分強(qiáng)、弱毒株的3套特異性引物，并對(duì)反應(yīng)溫度、甜菜堿濃度及Mg2+濃度分別進(jìn)行優(yōu)化，建立了新城疫病毒強(qiáng)弱毒株LAMP鑒別檢測(cè)方法。結(jié)果表明該方法可成功地區(qū)別

5、不同基因型的NDV強(qiáng)弱毒株，而對(duì)常見(jiàn)雞源病毒均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，該方法且對(duì)NDV RNA的最小檢測(cè)限為0.01pg，靈敏度是RT-PCR方法的100倍，具有簡(jiǎn)便、快速和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，可用于臨床上區(qū)分NDV強(qiáng)弱毒的快速檢測(cè)。
　　 根據(jù)GenBank公布的NDV和DPV的基因序列，設(shè)計(jì)了針對(duì)NDV和DPV的保守基因序列的2對(duì)特異性引物，運(yùn)用二重PCR方法對(duì)加入同一反應(yīng)管中的NDV和DPV模板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果得到了2條大小與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的