鴨源新城疫病毒廣西強毒分離株遺傳進化分析、檢測方法及DNA疫苗的研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起禽類的一種高發(fā)病率和死亡率的烈性傳染病。目前我國山東、浙江和廣東等地相繼報道該疾病在鴨群中流行，已給養(yǎng)鴨業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失。
　　 本文對鴨源NDV廣西分離株GX19/2011進行生物學(xué)特性的研究，結(jié)果表明:廣西分離株GX19/2011的ELD50為10-9.48/0.1 mL、MDT為51.4h、ICPI為

2、1.80、IVPI為2.82，推測該分離株GX19/2011為NDV強毒。用該毒株分別對35日齡和50日齡的鴨進行人工感染，35日齡、50日齡的鴨的發(fā)病率都為100％，死亡率分別為100％，70％。對鴨源NDV廣西分離株GX19/2011的全基因進行測序并進行分析，該毒株全長為15192bp，與F48E8，GD09-2，JS/1/02/Du，JS/1/97/Ch參考毒株的親緣關(guān)系較近，F(xiàn)基因核苷酸同源性為98.9％-99.1％，氨基酸的

3、同源性為99.6％-99.8％。但與Lasota的同源性相對較低，F(xiàn)基因核苷酸的為88.1％，氨基酸為91.9％。進化樹分析表明，該分離株屬于基因Ⅸ。該分離株F蛋白裂解位點的氨基酸序列為112R-R-Q-R-R-F117，符合強毒株的裂解位點的氨基酸組合。
　　 根據(jù)GenBank中鴨源NDV的F基因和鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus，DuCV)的V1/rep基因的保守序列各設(shè)計一對特異性引物，并優(yōu)化擴增條件，建立了同

4、時檢測鴨NDV和DuCV的二重PCR方法。該方法特異性好，對番鴨細小病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨源小鵝瘟病毒、鴨H9亞型流感病毒、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌等病原核酸無特異性擴增。該方法的敏感性高，對鴨NDV的核酸最小檢測量為40fg,對DuCV的為20fg。根據(jù)GenBank公布的鴨源NDV、鴨瘟病毒(Duck Plague virus，DPV)和DuCV基因序列，設(shè)計了3對特異性引物并建立了鑒別診斷鴨源NDV、DP

5、V和DuCV的多重PCR檢測方法。該方法特異性好，對番鴨呼腸孤病毒、鴨源GPV、H5亞型流感、鴨源H9亞型流感病毒、鴨疫里默氏桿菌、E.coli、禽多殺性巴氏桿菌等病原核酸無特異性擴增;敏感性高，鴨源NDV、DPV和DuCV的核酸最低檢出限分別10pg、4pg、1.5 pg。對180份病料進行檢測，結(jié)果DuCV陽性10份，陽性率為5.6％;鴨源NDV陽性1份，陽性率為0.56％。結(jié)果表明，建立的多重PCR方法可以應(yīng)用于鴨源NDV、DPV

6、和DuCV的臨床檢測和流行病學(xué)調(diào)查。根據(jù)鴨源NDV和DuCV保守基因序列，設(shè)計了2對針對鴨源NDV和DuCV的特異性引物和2條不同熒光基團標(biāo)記的TaqMan探針，建立了鴨源NDV和DuCV的二重實時熒光定量PCR檢測方法。該方法特異性性好，對番鴨細小病毒、鴨瘟病毒、鴨肝炎病毒、鴨源小鵝瘟病毒、鴨H9亞型流感病毒、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、禽多殺性巴氏桿菌等病原核酸無特異性擴增;敏感性高，對鴨源NDV的最小檢測量是160拷貝，DuCV的為

7、140拷貝。應(yīng)用該方法對保存118份臨床病料核酸進行檢測，結(jié)果檢出鴨副粘病毒和鴨圓環(huán)病毒陽性感染率分別為0.85％和8.47％，無混合感染。試驗結(jié)果表明，建立的三種方法都具有快速、特異、敏感等優(yōu)點，適用于獸醫(yī)臨床和實驗室檢測。
　　 根據(jù)鴨源NDV F基因和DuCV Cap基因開放閱讀框序列，設(shè)計了2對特異性引物，PCR擴增出鴨源NDV的F基因和DuCV的Cap基因，并將其克隆到真核表達載體pcDNA3.1，成功構(gòu)建重組融合表達

8、質(zhì)粒 pcDNA3.1-F-Cap。經(jīng)酶切和測序鑒定正確后，將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-F-Cap轉(zhuǎn)染Vero細胞，采用間接免疫熒光檢測到目的基因的體外表達。將pcDNA3.1-F-Cap作為DNA疫苗對2周齡的SPF雛鴨以胸部肌肉多點注射的方式進行免疫，根據(jù)接種劑量的不同，分3個實驗組，每組10只，即接種劑量分別為100μg/只、200μg/只和300μg/只，同時設(shè)載體質(zhì)?？瞻捉M和滅活疫苗組，一免后兩周進行一次加強免疫。每次免疫前和

9、攻毒前各采一次血，ELASA檢測抗體水平。試驗結(jié)果顯示:各DNA疫苗免疫組的NDV抗體和DuCV抗體水平明顯高于載體空白對照組，差異顯著(P＜0.05);二免后不同DNA劑量組間的抗體水平隨著免疫劑量的增大而增加，差異顯著(P＜0.05);二次免疫后，各疫苗試驗組的抗體水平明顯高于一次免疫(P＜0.05)，說明加強免疫有利于抗體水平的提高。于第二次免疫后2周，使用分離株GX2011/19以滴鼻的方式每只SPR鴨接種0.5ml106.48