新城疫病毒廣西分離株DNA疫苗的構(gòu)建、動物免疫試驗及體內(nèi)分布的研究.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是一種急性、高度接觸性和致死性的禽類傳染病，該病的發(fā)生給世界養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的損失，被國際獸疫局(Office International des Epizooties，OIE)列為A類疫病，其病原為新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)。近年來對新城疫病毒生物學(xué)特性的測定、新型疫苗的研究以及分子流行病學(xué)調(diào)查等一直是研究的熱點。本文對NDV廣西分離株GX7/

2、02進(jìn)行了生物學(xué)特性的測定和NDA疫苗的構(gòu)建，動物免疫試驗及體內(nèi)分布的研究。 參照國際上規(guī)定的新城疫病毒生物學(xué)特性判斷的標(biāo)準(zhǔn)及方法，對新城疫廣西分離野毒株GX7/02進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，結(jié)果顯示，該毒株的雞胚半數(shù)致死量(ELD50)為10<'-9.42>/0.1 mL，雞胚半數(shù)感染量(EID50)為10<'-9.57>/0.1mL，雞胚最小致死量平均死亡時間(MDT)為54.Oh，雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)組織培養(yǎng)半數(shù)感染量(T

3、CID50)為10<'-9.50>/0.1 mL，腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為1.925，6周齡雞靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)(1VP1)為2.43。表明該分離株具有與新城疫病毒速發(fā)型相類似的毒力，隸屬于強毒株。用該分離株對16日齡的雞、鴨、鵝分別進(jìn)行人工感染試驗，發(fā)病率分別為100％、40％和100％，死亡率分別為100％、0和60％。且試驗證明GX7/02毒株屬于血凝快速解脫型，血凝素?zé)岱€(wěn)定性較差。 設(shè)計兩對特異性引物，采用RT-PCR

4、技術(shù)擴(kuò)增出新城疫廣西分離株GX7/02的F和HN基因，將其分別克隆入真核表達(dá)載體pTracer-CMV2質(zhì)粒中，置于PCMV啟動子之下，構(gòu)建成pTracer-CMV2F和pTracer-CMV2HN重組質(zhì)粒。另設(shè)一對特異性引物，采用PCR技術(shù)從重組質(zhì)粒pMD18-T-IL2中擴(kuò)增出IL2基因，克隆入pTracer-CMV2F和pTracer-CMV2HN重組質(zhì)粒中，置于PEF1啟動子之下，構(gòu)建成pTracer-CMV2FIL2和pTra

5、cer-CMV2HNIL2重組質(zhì)粒。經(jīng)酶切和序列測定正確后，采用脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于BHK-21細(xì)胞。 采用間接免疫熒光和RT-PCR方法檢測到目的基因的表達(dá)。將 pTracer-CMV2FIL2和pTracer-CMV2HNIL2以單獨和聯(lián)合(1：1)接種的方式分別免疫于兩周齡的SPF雞只，每只200ug。其中混合免疫的雞只包括三個組，分別接種一次、兩次和三次。接種后每周采血一次，ELISA方法檢測抗體水平，并于接種后6周

6、進(jìn)行攻毒試驗。試驗結(jié)果顯示，接種DNA疫苗的各組抗體水平明顯高于對照組，差異極顯著(P<0.01)；pTracer-CMV2FIL2和pTracer-CMV2HNIL2分別單獨免疫組抗體水平差異不顯著(P>0.05)；而聯(lián)合免疫組的抗體水平均明顯高于單獨免疫組，差異顯著(P<0.05)；且抗體水平隨著免疫次數(shù)的增多而升高，差異顯著(P<0.05)。攻毒試驗顯示聯(lián)合免疫組的保護(hù)率均高于單獨免疫組。為了研究接種以后DNA疫苗在體內(nèi)的分布情況

7、、表達(dá)時間、持續(xù)存在的時間以及在血液中的動態(tài)分布情況，將3周齡的三黃雞肌肉接種200 μg DNA疫苗pTracer-CMV2FIL2，巢式PCR法檢測血清、心、脾臟、肺臟、法氏囊、腦、骨髓、胸腺和肌肉接種部位中pTracer-CMV2FIL2出現(xiàn)和存留的時間；熒光定量PCR法檢測其在血液中的動態(tài)變化；RT-巢式PCR法檢測其在上述部位的表達(dá)情況。試驗結(jié)果表明，接種后2～3小時血清中可檢測到 pTracer-CMV2FIL2，6h時在血

8、液中的含量最高，7d時已經(jīng)檢測不到；4h后在上述器官中可陸續(xù)檢測到pTracer-CMV2FIL2的出現(xiàn)，13d后陸續(xù)消失：1d后可陸續(xù)檢測到質(zhì)粒所轉(zhuǎn)錄的mRNA，13d后陸續(xù)消失；接種后2h可在肌肉接種部位的細(xì)胞中檢測到pTracer-CMV2FIL2的出現(xiàn)，10h可檢測到mRNA，150d時仍然可以在肌肉接種部位的細(xì)胞中檢測到質(zhì)粒和mRNA存在。本研究為DNA疫苗的臨床應(yīng)用提供可靠的試驗依據(jù)。 參照國家獸醫(yī)生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，