種鴨生殖系統(tǒng)新城疫病毒檢測及鴨新城疫病毒垂直感染動(dòng)物試驗(yàn).pdf

1、鴨新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種急性、敗血性傳染病，該病可造成鴨的大量死亡，對(duì)養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重。加強(qiáng)對(duì)該病的診斷方法和傳播方式的研究對(duì)預(yù)防和控制鴨新城疫的發(fā)生，保護(hù)和促進(jìn)養(yǎng)鴨業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。本研究建立了兩種新城疫病毒的檢測方法，即鴨源新城疫病毒RT-PCR診斷方法和間接免疫熒光染色方法，并應(yīng)用這兩種方法對(duì)人工感染種鴨生殖系統(tǒng)新城疫病毒進(jìn)行了檢測，同時(shí)進(jìn)行了鴨新城疫病毒垂直

2、感染動(dòng)物試驗(yàn)。
　　 本研究內(nèi)容包括四部分：
　　 一、鴨源新城疫病毒RT-PCR診斷方法的建立與應(yīng)用根據(jù)GenBank中新城疫 F基因序列設(shè)計(jì)、合成了1對(duì)引物擴(kuò)增相對(duì)保守的727 bp的目的片段，建立了鴨源新城疫病毒病的RT-PCR診斷方法。該方法能從鴨源新城疫病毒SDFCH株擴(kuò)增到727bp的特異性片段，而鴨瘟病毒、H9N2亞型流感病毒、鴨肝炎病毒擴(kuò)增結(jié)果為陰性，敏感性試驗(yàn)最低檢出量的cDNA濃度為3pg/μL。表明

3、所建立的RT-PCR方法特異性強(qiáng)、敏感性高。應(yīng)用該方法對(duì)山東不同地區(qū)20株疑似鴨新城疫病毒分離株進(jìn)行檢測，結(jié)果15份為陽性；對(duì)150份疑似新城疫病鴨的感染病變組織進(jìn)行檢測，結(jié)果125例為陽性。
　　 二、鴨源新城疫病毒間接免疫熒光染色檢測方法的建立以抗新城疫病毒F蛋白的單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC-羊抗小鼠IgG為二抗，同時(shí)優(yōu)化固定液、黏片劑、洗滌液、抗體稀釋度及孵育時(shí)間、封片劑等試驗(yàn)條件并進(jìn)行標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照、熒光抗體對(duì)照、吸收

4、試驗(yàn)、替代試驗(yàn)等特異性試驗(yàn)，建立了間接免疫熒光染色方法。結(jié)果顯示，感染NDV發(fā)病死亡鴨的輸卵管不同部位、肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、胰腺、腦、心臟等組織切片IFA檢測發(fā)出明亮的黃綠色熒光，呈陽性。正常健康對(duì)照組種鴨鴨臟器組織切片IFA檢測未發(fā)出黃綠色熒光，呈陰性。對(duì)鴨瘟病毒、禽流感病毒、鴨疫里默氏桿菌、Ⅰ型鴨肝炎病毒感染致死鴨的病變組織檢測均無黃綠色熒光，呈陰性。結(jié)果表明建立的間接免疫熒光染色檢測方法特異性強(qiáng)。
　　 三、人工感染種

5、鴨生殖系統(tǒng)新城疫病毒的檢測應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室分離的一株經(jīng)鴨胚傳遞的新城疫病毒SDFCH株，對(duì)42只無新城疫病毒感染的28周齡櫻桃谷種鴨進(jìn)行人工感染試驗(yàn)，試驗(yàn)分A、B、C 3組，A組母鴨攻毒組，B組公鴨攻毒組，C組為對(duì)照組。攻毒4 d后，每隔2 d每組各撲殺2只，采集母鴨卵巢、輸卵管，公鴨采集睪丸、輸精管。對(duì)上述組織進(jìn)行病毒分離鑒定，并利用已建立的RT-PCR方法進(jìn)行F基因的擴(kuò)增與同源性分析，確定在上述組織器官中是否存在鴨源新城疫病毒SDFCH

6、株。同時(shí)用已建立間接免疫熒光染色方法檢測輸卵管內(nèi)新城疫病毒及病毒在輸卵管的分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RT-PCR方法能在種鴨生殖系統(tǒng)各個(gè)組織中重新分離到新城疫病毒SDFCH株，輸卵管子宮部和蛋白分泌部纖毛柱狀上皮的纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞內(nèi)有陽性熒光信號(hào)存在。
　　 四、鴨源新城疫病毒垂直感染動(dòng)物試驗(yàn)應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室分離的一株經(jīng)鴨胚傳遞的新城疫病毒SDFCH株，對(duì)68只無新城疫病毒感染的28周齡櫻桃谷種鴨進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。攻毒采集母鴨卵巢、輸卵管

7、、未產(chǎn)出的種蛋，以及產(chǎn)出后及時(shí)消毒的種蛋，出殼后的雛鴨胎糞、腦、肺等。公鴨采集睪丸、輸精管、精液。結(jié)果H.E.染色后病理組織學(xué)變化，表現(xiàn)為輸卵管毛細(xì)血管出血，黏膜脫落，IFA檢測固有層淋巴細(xì)胞浸潤等輸卵管纖毛柱狀上皮的纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞內(nèi)有陽性信號(hào)存在，從母鴨及公鴨生殖系統(tǒng)各組織、胚蛋以及80％雛鴨中能分離和檢測到新城疫病毒SDFCH株。結(jié)果顯示，鴨源新城疫病毒能存在于母鴨輸卵管粘膜上皮細(xì)胞及公鴨精液中，并隨蛋白分泌、卵黃的形成、精液的