東方巴貝斯蟲(chóng)棒狀體相關(guān)蛋白1(RAP1)基因克隆及免疫特性研究.pdf

1、東方巴貝斯蟲(chóng)(Babesia orientalis，簡(jiǎn)稱：B.o)是一種由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播的血液原蟲(chóng)，主要引起水牛發(fā)病，臨床癥狀以高熱，貧血，黃疸，消瘦和血紅蛋白尿等為特征，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致水牛死亡。東方巴貝斯蟲(chóng)的發(fā)現(xiàn)到目前已經(jīng)有二十多年，盡管對(duì)其形態(tài)學(xué)、流行病學(xué)、生活史、分子分類和診斷技術(shù)等方面進(jìn)行了詳細(xì)的研究，但關(guān)于該病原的入侵機(jī)制以及候選疫苗篩選等方面的研究仍然有限。因此，本研究在建立的東方巴貝斯蟲(chóng)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)上，克隆與蟲(chóng)體入侵

2、相關(guān)的棒狀體相關(guān)蛋白1(RAPl)基因，對(duì)其進(jìn)行氨基酸序列和進(jìn)化分析，隨后對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)及免疫熒光定位，從而為闡明東方巴貝斯蟲(chóng)的入侵和免疫機(jī)制提供依據(jù)。
　　 (1)東方巴貝斯蟲(chóng)RAP1基因克隆及其結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
　　 根據(jù)從數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的東方巴貝斯蟲(chóng)RAP1基因的相關(guān)信息設(shè)計(jì)一對(duì)特異性的引物RAP1-F/RAP1-R，從東方巴貝斯蟲(chóng)基因組擴(kuò)增到一條1732bp的包含RAP1基因全長(zhǎng)的序列?；蛐蛄蟹治霰砻髌浒粋€(gè)1434b

3、p的ORF，編碼477個(gè)氨基酸。同源性分析表明，此蛋白基因序列與羊巴貝斯蟲(chóng)RAP1(Babesia ovis RAP1)基因(GenBank序列號(hào)：M91173.1)的第二個(gè)CDS序列同源性最高為71%；與牛巴貝斯蟲(chóng)(Babesia bovis；AF030058.1)、駑巴貝斯蟲(chóng)(Babesia caballi；AB017700.1)、犬巴貝斯蟲(chóng)(Babesia canis；M91168.1)的同源性分別為68%、63%和64%。預(yù)測(cè)的

4、氨基酸序列與牛巴貝斯蟲(chóng)(GenBank序列號(hào)：AAB84268.1)的同源性最高為58%；與羊巴貝斯蟲(chóng)(AAA27805.1)、駑巴貝斯蟲(chóng)(ADF30793.1)、犬巴貝斯蟲(chóng)(AAA27807.1)的同源性分別為43%、48%和42%。RAP1氨基酸序列的進(jìn)化分析表明東方巴貝斯蟲(chóng)是歸屬于巴貝斯蟲(chóng)的一個(gè)獨(dú)立的新種。結(jié)構(gòu)分析表明，它具有巴貝斯蟲(chóng)RAP1基因家族所特有的一些氨基酸結(jié)構(gòu)特征，如N末端具有一個(gè)17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽；四個(gè)保守半胱氨酸

5、殘基；十四個(gè)氨基酸保守基序；前300個(gè)氨基酸的一些保守的基序以及C末端的5個(gè)串連的重復(fù)區(qū)域等。
　　 (2)東方巴貝斯蟲(chóng)RAP1原核表達(dá)、免疫定位及免疫反應(yīng)原性
　　 根據(jù)RAP1基因的序列結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其主要的預(yù)測(cè)功能位點(diǎn)都處在N末端的前三百個(gè)氨基酸內(nèi)，本研究將克隆的東方巴貝斯蟲(chóng)RAP1開(kāi)放閱讀框全長(zhǎng)(RAP1-F)和N末端834bp片段(RAP-N)連接到原核表達(dá)載體pGEX-KG，成功的構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG

6、-RAP1-F和pGEX-KG-RAP1-N。利用原核表達(dá)所得的重組蛋白GST-RAP1-F和GST-RAP1-N免疫新西蘭白兔成功的制備了多克隆抗體。利用東方巴貝斯蟲(chóng)感染水牛陽(yáng)性血清的Western-blot分析表明，GST-RAP1-F和GST-RAP1-N都具有良好的反應(yīng)原性。間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明東方巴貝斯蟲(chóng)RAP1定位在紅細(xì)胞內(nèi)的蟲(chóng)體表面。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功的克隆了東方巴貝斯蟲(chóng)RAP1基因，其基因序列與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析為進(jìn)一