牛紅細胞表面受體糖蛋白和東方巴貝斯蟲球狀體蛋白3基因的克隆表達及分析.pdf

1、東方巴貝斯蟲(Babesia orientalis)是一種由鐮形扇頭蜱經(jīng)卵傳播的血液原蟲，只引起水牛巴貝斯蟲病。本實驗室前期的研究證實東方巴貝斯蟲是一獨立新種。因為東方巴貝斯蟲只感染水牛，不感染黃牛和奶牛，推測可能與不同巴貝斯蟲入侵配體或不同種牛紅細胞受體的不同有關(guān)。由于東方巴貝斯蟲裂殖子入侵紅細胞的分子過程還不清楚，為從分子水平上尋找東方巴貝斯蟲僅感染水牛而不感染黃牛和奶牛的原因，本研究主要從東方巴貝斯蟲入侵相關(guān)的牛紅細胞受體與東方巴

2、貝斯蟲入侵相關(guān)配體兩方面進行研究。
　　 1.牛紅細胞表面受體糖蛋白基因的克隆，分析與表達。
　　 (1)黃牛、奶牛和水牛紅細胞表面受體GYPC、DARC和GYPA基因的克隆及序列分析
　　 根據(jù)GenBank公布的牛Glycophorins C(GYPC)、Duffy antigen/chemokinereceptor(DARC)、Glycophorins A(GYPA)基因序列分別設(shè)計四對、兩對、六對特異性引

3、物，采用PCR方法分別從黃牛、奶牛和水牛全血基因組中擴增得到GYPC、DARC、GYPA的基因片段，分別構(gòu)建克隆載體后測序鑒定。利用clustalx和PrimerPremier5.0拼接GYPC四個外顯子序列、DARC的兩個外顯子序列和GYPA的六個外顯子序列。利用DNAStar軟件預(yù)測黃牛、奶牛和水牛的GYPC、DARC和GYPA的親水性、抗原性、表面活性、等電點、一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)等，利用在線軟件預(yù)測跨膜區(qū)，糖基化位點和信號肽，并進

4、行比較分析。結(jié)果表明水牛GYPC、GYPA的一級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)，等電點，糖基化位點與數(shù)目與黃牛和奶牛的GYPC都有較大差異；黃牛、奶牛和水牛DARC的等電點，一級結(jié)構(gòu)，二級結(jié)構(gòu)，等電點，跨膜區(qū)，糖基化位點都有差異。
　　 (2)黃牛GYPA基因的真核表達
　　 將人工合成的黃牛GYPA基因插入真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，并連接綠色熒光蛋白基因EGFP，pCDNA3.1(+)-GYPA-EGFP質(zhì)粒測序鑒定后，通

5、過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染PK，MDBK細胞，24h時可以看到綠色熒光，36h時熒光最強?？瞻谉晒鈱φ召|(zhì)粒pCDNA3.1(+)-EGFP的熒光分布于細胞內(nèi)，pCDNA3.1(+)-GYPA-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后熒光分布在細胞膜周圍且熒光強度弱于空白熒光對照質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-EGFP，這是由于GYPA基因含有信號肽，蛋白質(zhì)表達后分泌到細胞表面，而且目的蛋白的表達降低了熒光蛋白的強度。
　　 總之，通過黃牛、奶牛和水牛GYPC、DA

6、RC和GYPA的克隆和序列比較分析，推測水牛GYPC、GYPA序列與黃牛、奶牛的差異較大，可能是東方巴貝斯蟲只感染水牛的原因，具有深入研究價值。
　　 2.東方巴貝斯蟲SBP3基因的克隆，序列分析，原核表達及免疫反應(yīng)性研究
　　 (1)東方巴貝斯蟲SBP3基因的克隆及序列分析
　　 利用本實驗室東方巴貝斯蟲基因組測序結(jié)果和GenBank中相關(guān)的牛巴貝斯蟲SBP3基因序列，設(shè)計特異引物，以含蟲全血基因組作為模板，通

7、過PCR擴增獲得東方巴貝斯蟲的SBP3基因，測序結(jié)果顯示序列全長為3237bp，為一個完整的開放閱讀框，推測出蛋白質(zhì)分子量為118kDa，含1079個氨基酸殘基。基因序列同源性分析分析結(jié)果表明東方巴貝斯蟲與牛巴貝斯蟲SBP3(GenBank序列號：AF107117.1)序列同源性最高為70%，東方巴貝斯蟲SBP3比牛巴貝斯蟲基因序列少33bp，蛋白質(zhì)序列少11AA，進一步說明東方巴貝斯蟲是新種。利用DNAStar軟件中的Protean預(yù)

8、測東方巴貝斯蟲SBP3抗原決定簇，結(jié)果表明其具有良好的抗原性。
　　 (2)東方巴貝斯蟲SBP3的原核表達及免疫反應(yīng)性研究
　　 SBP3基因截短表達，分三段命名為SBP3-1，SBP3-2，SBP3-3，長度分別為927bp，1329bp，1026bp。克隆入pET-28a(+)原核表達載體中，構(gòu)建pET-28a(+)-SBP3-1，pET-28a(+)-SBP3-2，pET-28a(+)-SBP3-3原核表達質(zhì)粒。將

9、構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21-CondonPlus，IPTG誘導(dǎo)HIS-SBP3融合蛋白表達。Western-blot檢測獲得40kD，53kD，42kD的目的帶，大小與蛋白理論預(yù)測值相符，表明SBP3重組蛋白與東方巴貝斯蟲病陽性牛血清的天然抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，說明東方巴貝斯蟲SBP3具有很好的免疫反應(yīng)原性。
　　 本研究完成了東方巴貝斯蟲SBP3的克隆，原核表達，Western-blot，表明SBP3可作為潛在的免疫檢測和