巴貝斯蟲(chóng)兩種蛋白酶的鑒定及與蜱分子的互作研究.pdf

1、巴貝斯蟲(chóng)病是由巴貝斯蟲(chóng)引起的一種血液寄生蟲(chóng)病，主要通過(guò)硬蜱傳播，會(huì)引起人和宿主動(dòng)物發(fā)熱、貧血、血尿，甚至死亡。田鼠巴貝斯蟲(chóng)（Babesia.microti）是最重要的人獸共患巴貝斯蟲(chóng)之一，嚴(yán)重危害人類健康，所以巴貝斯蟲(chóng)的防治工作顯得尤為重要。半胱氨酸蛋白酶（Cysteine protease）是在酶活性中心含有半胱氨酸殘基的蛋白水解酶，屬于木瓜蛋白酶家族，它的分布范圍很廣，從病毒到脊椎動(dòng)物的生物體。寄生蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶大多屬于木瓜蛋白酶

2、樣蛋白酶（Papain like protease）（CA族）內(nèi)的C1族（組織蛋白酶B、組織蛋白酶L）和C2族（鈣激活蛋白酶樣蛋白酶）。組織蛋白酶E（Cathepsin E）是主要的細(xì)胞內(nèi)天冬氨酸蛋白酶，主要存在于免疫系統(tǒng)的細(xì)胞中，涉及MHC II類途徑介導(dǎo)的抗原加工。有研究表明，Cathepsin E在感染晚期階段有助于寄生蟲(chóng)的清除。這些蛋白酶在寄生蟲(chóng)的生存和發(fā)育中起著重要的作用，是關(guān)鍵的藥物靶標(biāo)。本研究針對(duì)田鼠巴貝斯蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶

3、和組織蛋白酶E進(jìn)行了探索性研究。同時(shí)，探索了田鼠巴貝斯蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶與蜱體分離的半胱氨酸抑制分子（Cystatin分子）的互作關(guān)系。
　　通過(guò)對(duì)田鼠巴貝斯蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，篩選出在田鼠巴貝斯蟲(chóng)發(fā)育和生存中有重要作用的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶以及組織蛋白酶E。篩選出的半胱氨酸蛋白酶基因，命名為BmCYP，大小為1418 bp，包含一個(gè)大小為1338 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼445個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為49.7 kDa，

4、等電點(diǎn)為8.48，無(wú)信號(hào)肽序列，預(yù)測(cè)蛋白的酶活性中心（-QGACGSCWAFAT和SM HAV LL VGYG-），正是BmCYP具有催化活性的結(jié)構(gòu)域。篩選的組織蛋白酶E基因命名為BmCATEB，開(kāi)放閱讀框大小為1440 bp，編碼449個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為53.4 kDa，等電點(diǎn)為6.11，也無(wú)信號(hào)肽，預(yù)測(cè)蛋白的酶活性中心為AAVDTGSSLITT。將兩基因分別克隆到pET28a質(zhì)粒中，然后轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌E.coli BL21，經(jīng)

5、IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，用Ni-NTA樹(shù)脂純化蛋白。Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，His單抗均可識(shí)別重組蛋白。酶活性分析表明，BmCYP與BmCATEB分別具有半胱氨酸蛋白酶和組織蛋白酶E的活性。鐮形扇頭蜱的Cystatin分子RHcyst-1和RHcyst-2在感染與未感染巴貝斯蟲(chóng)蜱體內(nèi)的基因表達(dá)量分析表明，在半飽血若蜱階段，RHcyst-1和RHcyst-2基因顯著上調(diào)，在飽血若蜱及蛻皮后的成蜱階段，基因顯著下調(diào)。此外，蜱的半胱氨

6、酸蛋白酶抑制分子能有效抑制巴貝斯蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶的活性，且對(duì)組織蛋白酶E也有一定的抑制。
　　綜上所述，本研究分離鑒定了田鼠巴貝斯蟲(chóng)的兩個(gè)蛋白酶分子BmCYP與BmCATEB，結(jié)果顯示兩重組蛋白均具有蛋白酶活性。巴貝斯蟲(chóng)感染蜱后，引起蜱的RHcyst-1和RHcyst-2分子顯著變化，體外實(shí)驗(yàn)表明蜱的半胱氨酸蛋白酶抑制分子可抑制巴貝斯蟲(chóng)的半胱氨酸蛋白酶，提供了原蟲(chóng)與媒介互作的證據(jù)。這些研究結(jié)果對(duì)闡明蜱與原蟲(chóng)互作機(jī)制具有重要意義。