鼠羧肽酶原B和蛇毒金屬蛋白酶Alfimeprase兩種蛋白在畢赤酵母中表達(dá)研究.pdf

1、羧肽酶原B由胰腺細(xì)胞分泌，起初以含信號(hào)肽及前肽的前羧肽酶原B(preprocarboxypeptidase B)形式存在，在轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過(guò)程中被信號(hào)肽酶切除掉信號(hào)肽而形成無(wú)活性的羧肽酶原B(procarboxypeptidase B，proCPB)，羧肽酶原B在小腸經(jīng)胰蛋白酶特異水解剪切前肽后而被活化成羧肽酶B。 羧肽酶B(carboxypeptidase B，CPB)是一類可水解蛋白或多肽底物C—端Lys或Arg的金屬蛋白

2、酶。羧肽酶B在科研上主要用于蛋白質(zhì)、多肽的測(cè)序；在醫(yī)學(xué)上用于診斷胰腺炎；另外，羧肽酶B是重組胰島素的生產(chǎn)過(guò)程中不可缺少的一個(gè)工具酶。目前，商業(yè)途徑獲得的羧肽酶B主要從豬胰臟中提取，使得產(chǎn)品價(jià)格昂貴，同時(shí)也不可避免地混雜有其它蛋白酶，如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶。除了從胰腺組織中直接提取外，羧肽酶B也可通過(guò)基因工程途徑獲得。Hartman等和Li等分別研究了鼠CPB在大腸桿菌中的原核表達(dá)。Eaton等和Ventura等曾在畢赤酵母(Pichi

3、a pastoris)中分別表達(dá)了人血漿羧肽酶原B和豬胰腺羧肽酶原B。王德解等利用巴斯德畢赤酵母pAOX1系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)了鼠羧肽酶原B，為探索利用GAP啟動(dòng)子(pGAP)取代AOX1啟動(dòng)子(pAOX1)的重組質(zhì)粒在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中組成型表達(dá)鼠羧肽酶原B的可能性，本實(shí)驗(yàn)試圖利用巴斯德畢赤酵母pGAP系統(tǒng)組成型表達(dá)鼠羧肽酶原B。 本實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)GAP啟動(dòng)子目的基因的序列設(shè)計(jì)上下游引物，應(yīng)用PCR技術(shù)

4、以質(zhì)粒pIB2為模板擴(kuò)增了GAP啟動(dòng)子基因片段，在目的基因的兩端分別引入SacⅠ和BamHⅠ兩個(gè)酶切位點(diǎn)，將GAP啟動(dòng)子基因片段取代誘導(dǎo)型質(zhì)粒pPIC9K—proCPB上的AOX1啟動(dòng)子基因片段構(gòu)建組成型表達(dá)質(zhì)粒pGAPK—proCPB。用BglⅡ線性化pGAPK—proCPB重組質(zhì)粒后，經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化到巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，涂布MD平板，篩選出陽(yáng)性菌落，在含0.2％的葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)工程菌，首次實(shí)現(xiàn)了鼠羧肽酶原B在畢赤酵