約氏瘧原蟲子孢子侵入相關(guān)基因分析及235kDa棒狀體蛋白研究.pdf

1、蚊媒傳播的瘧疾是一種嚴(yán)重危害人類健康的熱帶傳染病，在全世界人群中具有很高的發(fā)病率和致死率。近年來(lái)瘧原蟲多藥抗性株的出現(xiàn)與迅速擴(kuò)散，以及蚊媒對(duì)殺蟲劑耐受性的增加，目前又無(wú)有效的抗瘧疫苗，給瘧疾防治工作帶來(lái)很大的困難。傳統(tǒng)方法已難于控制該病的流行，迫切需要為瘧疾的防治工作提供新的方法和手段。瘧疾是由蚊蟲叮咬而傳播，瘧原蟲子孢子一旦進(jìn)入血循環(huán)，數(shù)分鐘后便隨血流跨過肝血竇枯否氏細(xì)胞(Kuppfercell，KC)后主動(dòng)粘附、迅速侵入肝細(xì)胞，并進(jìn)

2、行紅外期增殖，然后進(jìn)入紅細(xì)胞，導(dǎo)致瘧疾的發(fā)作。子孢子侵入肝細(xì)胞是瘧疾感染的關(guān)鍵，而阻斷蟲體的侵入，即可防止瘧疾感染，紅外期阻斷疫苗旨在阻斷子孢子侵入宿主肝細(xì)胞，防止瘧原蟲紅內(nèi)期的發(fā)育，是瘧疾疫苗的重要組成部分。 唾液腺子孢子感染性受發(fā)育調(diào)節(jié)。正常情況下，中腸內(nèi)卵囊成熟后破裂，子孢子逸出，經(jīng)血淋巴移行到唾液腺后2d，發(fā)育成為具有感染性的子孢子。因此研究瘧原蟲具有侵入肝細(xì)胞能力的唾液腺子孢子與不具侵入肝細(xì)胞能力的卵囊子孢子之間的差異

3、分子具有重要意義。通過對(duì)瘧原蟲子孢子不同時(shí)相點(diǎn)侵入相關(guān)基因和蛋白的研究與鑒定，將有助于認(rèn)識(shí)瘧原蟲生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制，可為瘧疾的防治提供分子理論依據(jù)，提供藥物和疫苗新的靶目標(biāo)，為采取防治策略戰(zhàn)勝瘧疾打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 在后基因組時(shí)代，對(duì)基因功能的分析已成為當(dāng)前的主要任務(wù)。而功能基因組學(xué)最大的技術(shù)挑戰(zhàn)是關(guān)于蛋白表達(dá)的分析(蛋白質(zhì)組學(xué))。在本實(shí)驗(yàn)室前期的研究中，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)的二維凝膠電泳(two-dimensionalgelelec

4、trophoresis，2-DE)技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/inoizationtimeofflyingmassspectrometry，MALDI-TOF-MS)分析技術(shù)和蛋白質(zhì)信息學(xué)等方法對(duì)約氏瘧原蟲卵囊子孢子和唾液腺子孢子這兩個(gè)不同發(fā)育時(shí)期蟲體的可溶性蛋白進(jìn)行了分析研究。結(jié)果顯示相對(duì)于卵囊子孢子，在唾液腺子孢子中確定比較明顯的差異蛋白點(diǎn)有六個(gè)，分別為PyD

5、p1～6(Plasmodiumyoeliidifferentialprotein1～6)。這些差異蛋白點(diǎn)主要為一些膜蛋白、表面蛋白和運(yùn)動(dòng)相關(guān)的蛋白。推測(cè)這些蛋白可能與瘧原蟲子孢子黏附、侵入肝細(xì)胞相關(guān)，可能為新的阻斷策略和瘧疾多價(jià)亞單位疫苗的靶目標(biāo)。因此，加強(qiáng)這些差異表達(dá)蛋白的研究可為分子水平上篩選和發(fā)展抗瘧藥物和促進(jìn)疫苗研制奠定理論基礎(chǔ)。 對(duì)約氏瘧原蟲子孢子差異表達(dá)蛋白的結(jié)果進(jìn)行研究分析發(fā)現(xiàn)，差異蛋白點(diǎn)PyDp1(pI：pH4，

6、MW：24×103)與瘧原蟲頂端復(fù)合體棒狀蛋白Py235(Plasmodiumyoelii235kDarhoptryproteins，Py235)相匹配。Py235是一組能夠協(xié)助瘧原蟲侵入宿主細(xì)胞，與瘧原蟲的侵襲力密切相關(guān)的高分子量蛋白(235kDa)。在紅內(nèi)期，Py235蛋白參與對(duì)紅細(xì)胞進(jìn)行選擇性侵入，并在多個(gè)不同侵入階段均有表達(dá)。Py235存在于唾液腺子孢子中，推測(cè)其可能與子孢子侵入肝細(xì)胞相關(guān)。 因此本實(shí)驗(yàn)以斯氏按蚊-約氏瘧

7、原蟲為模型，在本實(shí)驗(yàn)室的飼養(yǎng)條件下，對(duì)目前較明確的瘧原蟲子孢子侵入相關(guān)基因進(jìn)行定性及半定量分析，以確定采集子孢子樣本的最佳時(shí)相點(diǎn)。再?gòu)耐僖合僮渔咦悠诒磉_(dá)的差異蛋白中選擇差異蛋白點(diǎn)PyDp1為研究基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜(peptidemassfingerprint，PMF)進(jìn)行分析鑒定。參考約氏瘧原蟲235kDa棒狀體蛋白的氨基酸序列及其相對(duì)應(yīng)的核酸序列，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)Py235引物，經(jīng)RT-P

8、CR方法與T-A克隆技術(shù)及核酸測(cè)序從約氏瘧原蟲子孢子中克隆到Py235基因部分序列，并在此基礎(chǔ)上對(duì)Py235基因進(jìn)行原核表達(dá)研究，同時(shí)在基因水平利用DNA斑點(diǎn)雜交對(duì)Py235基因在唾液腺子孢子的表達(dá)進(jìn)行定性分析，從而為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。 其實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果主要包括以下三個(gè)方面： 1、在約氏瘧原蟲-斯氏按蚊模型的基礎(chǔ)上，通過建立RT-PCR方法并結(jié)合Qantity-One凝膠分析軟件，對(duì)蚊體內(nèi)約氏瘧原蟲卵囊子孢子發(fā)育為

9、唾液腺子孢子不同時(shí)相點(diǎn)的環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoiteprotein，CSP)與紅細(xì)胞結(jié)合蛋白(apicalmembraneantigen-erythrocyte-binding-likeprotein，MAEBL)基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果提示，按蚊體內(nèi)子孢子發(fā)育過程中CSP和MAEBL表達(dá)量的持續(xù)增加，并在唾液腺子孢子中達(dá)到峰值。隨著子孢子發(fā)育的越成熟，基因表達(dá)量越高。這為研究其它侵入相關(guān)基因的表達(dá)奠定了理論基礎(chǔ)。

10、 2、本研究以唾液腺子孢子差異蛋白點(diǎn)PyDp1為研究基礎(chǔ)，結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜進(jìn)行分析鑒定，獲得Py235棒狀體蛋白氨基酸序列及對(duì)應(yīng)的核酸序列，參考這些序列結(jié)果，利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)Py235引物。應(yīng)用RT-PCR方法及定向克隆技術(shù)和pET表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a(+)-Py235以及工程菌株XL1-Blue-pET28a(+)-Py235。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，工程菌株XL1-Blue-p

11、ET28a(+)-Py235成功表達(dá)了以包涵體形式存在的Py235融合蛋白。為進(jìn)一步深入的分析該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、空間構(gòu)象及功能結(jié)構(gòu)域等研究提供了基礎(chǔ)。 3、以獲得的Py235基因測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異的寡核苷酸探針并在5'端標(biāo)記地高辛，通過地高辛標(biāo)記的Py235基因探針與唾液腺子孢子DNA進(jìn)行斑點(diǎn)雜交反應(yīng)。結(jié)果顯示Py235基因探針可以和相應(yīng)的唾液腺子孢子基因組反應(yīng)，并且有比較好的特異性和敏感性，進(jìn)一步證實(shí)了目的基因的存在。