C3G-Rap1信號(hào)通路中Rap1表達(dá)對(duì)Rap1酶活性及卵巢惡性浸潤能的貢獻(xiàn).pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:探討C3G/Rap1信號(hào)通路中Rap1蛋白對(duì)Rap1酶活性及卵巢癌惡性浸潤能的貢獻(xiàn),并分析其可能的機(jī)制。
  方法:
  1.免疫印跡檢測驗(yàn)證上皮性卵巢癌組織中Dock180與C3G的表達(dá)相關(guān)性;免疫組化比較卵巢癌組織中Dock180與C3G的表達(dá)趨勢;免疫熒光觀察SKOV3中Dock180與C3G及它們各自的下游蛋白R(shí)ac1/Rap1的定位。
  2.免疫印跡檢測并比較Rap1在上皮性卵巢癌組織、卵巢良性組織和

2、正常卵巢組織中的表達(dá)。
  3.應(yīng)用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建三個(gè)Rap1 shRNA真核表達(dá)載體;用LipofectamineTM2000將三個(gè)重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒、陰性質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)卵巢癌細(xì)胞株SKOV3,通過免疫印跡對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行有效性篩選,G418篩選建立SKOV3-Rap1-RNAi穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
  4.觀察Rap1基因沉默后卵巢癌細(xì)胞株SKOV3中Rap1酶活性的變化及其生物學(xué)行為的影響:免疫熒光觀察焦點(diǎn)粘連的形成,MT

3、T實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)、Matrigel Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的惡性表型,明膠酶譜法檢測明膠酶活性的變化,GST-pull down實(shí)驗(yàn)檢測Rap1酶活性的改變。
  結(jié)果:
  1.Dock180與C3G在卵巢癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)相反趨勢;C3G/Dock180均主要分布于胞質(zhì),下游效應(yīng)蛋白R(shí)ap1/Rac1在胞膜和胞質(zhì)都有表達(dá),但Rap1以胞質(zhì)為主,而Rac1可以伸展至胞膜及胞膜皺褶。
  2.與卵巢良性

4、組織和正常卵巢組織相比,卵巢癌組織中Rap1呈現(xiàn)高表達(dá)(P<0.05)。
  3.設(shè)計(jì)三個(gè)針對(duì)人Rap1基因的三個(gè)siRNA片段,經(jīng)雙酶切和DNA測序證實(shí)成功構(gòu)建了三個(gè)重組質(zhì)粒p SUPER.retro.neo/GFP-Rap1i-#1,-Rap1i-#2,及-Rap1i-#3。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染提示質(zhì)粒pSUPER.retro.neo/GFP-Rap1i-#1,-Rap1i-#2,及-Rap1i-#3的Rap1抑制效率分別是50%,66%

5、,19%,遂最終采用pSUPER.retro.neo/GFP-Rap1i-#2轉(zhuǎn)染并用G418篩選出單克隆細(xì)胞Rap1i-1和Rap1i-2,其Rap1蛋白抑制率分別為70%和48%,我們選取Rap1i-1細(xì)胞進(jìn)一步驗(yàn)證Rap1沉默后細(xì)胞表型及Rap1酶活性的變化。
  4.與對(duì)照組相比,Rap1沉默的細(xì)胞組腫瘤細(xì)胞焦點(diǎn)粘連的數(shù)量以及肌動(dòng)蛋白微絲骨架都無明顯變化,但表現(xiàn)出細(xì)胞增殖速度增快,細(xì)胞損傷修復(fù)能力增強(qiáng),而穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)

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